生物制品生產中支原體污染的檢測和預防

李小靜 練炳洲 鄧月嫦 王鳳國 梁榕麗 （廣東大華農動物保健品股份有限公司 廣東 新興 527400）

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生物制品生產中支原體污染的檢測和預防

李小靜 練炳洲 鄧月嫦 王鳳國 梁榕麗 （廣東大華農動物保健品股份有限公司 廣東 新興 527400）

支原體是生物制品中常見的一種污染微生物，工作環境、操作者本身、培養基、污染支原體的細胞、試驗器材和用來制備細胞的原始組織或器官都可能給生產帶來支原體的污染。生物制品一旦污染支原體，會引起質量下降，免疫效果得不到保證，嚴重時可造成人力、物力、財力上的巨大損失，因此在生物制品生產中，需嚴格保持無菌操作，建立快速有效的檢測方法，有效防止支原體的污染。

1 支原體的特點

支原體是最小能夠自我復制的原核生物，其大小介于細菌和病毒之間，結構簡單，無細胞壁，形態多樣，可通過細菌濾器。多數支原體適合在偏堿環境中生存，對酸性環境承受力差，對熱敏感，對一般抗生素不敏感。多數支原體污染比較隱蔽，一般肉眼很難辨識，顯微鏡下觀察，可見單個荷包樣菌落。

2 支原體檢測的方法

目前，支原體的檢測方法很多，常用主要有分離培養法、DNA熒光染色法、電鏡法、血清學方法以及核酸探針法，但在實際生產中受到諸多條件的限制，不可能全部應用于生產。培養法和PCR擴增法2種支原體的檢測方法，基本適用于所有的生物制品企業，且都比較容易操作。（1）培養法是目前國內外最常用的支原體檢測方法，也是目前最直接的檢測方法，通過將樣品接種到支原體培養基上觀察液體培養基的顏色變化和固體培養基上是否長有支原體菌落來判斷試驗結果，準確率高，一般支原體都能檢出，但此種方法培養時間長，需29d才能出最終結果。一般用于對種毒和成品的檢測。（2）PCR方法是一種模擬體內DNA復制的體外擴增方法。由于支原體菌體小，對營養要求高，生長緩慢，用培養法檢測一些原輔材料有一定的局限性，而PCR方法剛好彌補了這些不足，相對于培養法它快速、敏感、方便。主要用于對原輔材料(牛奶、蔗糖、細胞、培養基)和半成品的支原體檢驗。

2.1 培養法

1.1.1 試驗材料 支原體檢驗培養基(根據樣品選擇不同的培養基)，100ml玻璃瓶，培養皿，小試管(1.0×10cm)

1.1.2 試驗方法 （1）培養基的制備：①固體培養基的制備：固體平皿培養基是由固體培養基和輔液兩部分組成。使用前將固體培養基加熱至完全溶解，液體培養基置37℃水浴溶解，待固體培養基溫度降到60℃左右時將輔液(60ml固體培養基+13ml輔液)沿瓶壁加入，邊加邊搖動，動作要輕，避免產生氣泡，待二者混合均勻后按平皿規格加入適量培養基制成固體平皿培養基。②液體培養基的制備：將液體培養基無菌分裝到100ml玻璃瓶，20ml/瓶，分裝到小試管，1.8ml/管。（2）培養基靈敏度試驗：所有用于支原體檢測的培養基必須進行靈敏度試驗，無論是外購培養基或是自制培養基。改良Frey氏培養基以滑液支原體CVCC2960株為質控菌株，非禽源支原體培養基以豬鼻支原體CVCC361株為質控菌株。將質控菌作10倍系列稀釋至10-10，接種到液體和固體培養基，置37℃培養96h，液體培養基靈敏度達到109ccu/ml以上為合格，固體培養基靈敏度達到106ccu/ml以上為合格。

1.1.3 試驗步驟 （1）樣品檢驗：病毒性活疫苗取樣3~5瓶，如凍干制品則用液體培養基恢復到原量，混合后取5ml接種到小瓶培養基，再從小瓶中取混懸液0.6m1分別移植到2支小管、2個固體平皿培養基。小瓶、小管培養物放置37℃培養，平皿培養物放含5%CO2、37℃培養箱培養。每日觀察培養物顏色有無變黃或變紅的變化。5、10、15d分別從小瓶中取0.6ml培養物分別移植到2支小管、2個平板培養基。每次移植的小管和平皿需培養觀察14d，在觀察期內發現小瓶或任何1支小管顏色有變化，立即移植到小管和固體培養基，觀察液體培養基是否出現恒定的pH變化及固體培養基上有無菌落出現。（2）對照：每次移植培養的同時設陰陽性對照。

1.1.4 試驗結果 陰性對照無支原體生長，陽性對照液體培養基變黃，固體培養基有支原體菌落生長，則檢驗結果有效。固體培養基無菌落生長，則判定樣品無支原體污染。

2.2 PCR方法

2.2.1 試驗材料 RNA/DNA抽提試劑盒，支原體PCR試劑盒

2.2.2 試驗方法 （1）病毒模板RNA/DNA抽提：取樣品200ml按抽提試劑盒說明書進行操作，同時設立陰陽性對照，注意防止樣品之間的交叉污染和樣品與陽性對照的污染。（2）PCR擴增：每份總體積20ml，取16ml PCR反應液(用前混勻)，2ml Taq DNA聚合酶，2ml模板DNA，在PCR儀上按以下程序進行擴增：94℃3min，94℃30s，50℃30s，72℃45s，35循環，72℃延伸10min。（3）電泳：稱1g瓊脂糖于100ml50倍稀釋的TAE電泳液中，微波爐中完全溶解后，加入8ml染色液混勻，在電泳槽內倒入瓊脂糖凝膠，待凝固后取5μl的PCR擴增產物與1μl上樣緩沖液混合點樣于瓊脂糖凝膠孔中，并以DNA Marker DL2 000作為參照，以100V電壓電泳20min后紫外凝膠成像儀拍照。（4）試驗結果：陽性對照出現267bp的目的條帶，陰性對照出現191bp的內控條帶。被檢樣品也出現191bp的內控條帶，則表明樣品無支原體污染。

3 支原體污染的預防

支原體污染源可能存在于生產的各個細節：工作環境、操作者、培養基甚至細胞的交叉污染。這就要求生產及檢驗過程中嚴格遵循生物制品生產及檢驗規范，從自身做起，養成良好的工作習慣。

3.1 原材料控制

雞胚、細胞以及生產用血清等是生物制品的重要生產原材料，自從Robinson L B等首次報道細胞培養中的支原體污染以來，國內外關于支原體污染細胞和疫苗等生物制品的報道屢見不鮮。有研究表明約20多種支原體容易污染雞胚、細胞或血清，有的甚至出現多種支原體同時污染同一樣品的現象。因此生產前保持細胞或雞胚的純凈以及對雞胚或細胞生產前的檢驗，在整個疫苗生產過程中尤為重要。

首先，保持細胞或雞胚的純凈性。建立無支原體污染的SPF雞群是杜絕雞胚污染支原體最直接有效的方法。從SPF種雞群入手，建立完善的種雞、雞胚支原體檢驗體系，有效保證生產用雞胚的純凈性；在細胞培養方面，良好的個人衛生及操作規范是避免支原體污染的基礎條件，在保證基礎的同時從制度上建立完善的檢驗體系，從原代細胞開始，對每個代次的細胞都進行嚴格的支原體檢驗，保證任何代次的細胞都無支原體污染的潛在威脅，保證細胞系的純凈。其次，血清及培養液等是病毒培養過程中重要的營養液，同時也是支原體賴以生存的營養物質；血清和培養液本身的成分及來源都非常復雜，從源頭控制支原體對血清和培養液的污染難度非常大。這就要求要針對血清及各種培養液的特性進行嚴格的滅菌處理，在保證無菌的同時，使用前加強對血清及培養液的檢驗就成為阻止支原體污染的唯一屏障。

3.2 生產及檢驗環節控制

GMP和ISO是一種制度，一種規范。要實現對環境的控制，有效杜絕支原體的污染僅靠規范是遠遠不夠的，還需要工作人員的自律性及責任心。養成良好的工作習慣，嚴格執行各種規章制度，是避免生產及檢驗過程中支原體污染根基。一旦沒有自律性和責任心，任何規章制度都無法實現其價值。

首先，整體生產環境消毒：車間內部進行定期的清潔，使用3%新潔爾滅定期整體環境消毒，嚴格保證生產環境的無菌。同時細化生產流程中原材料、半成品以及成品的運送及傳輸路線，嚴格杜絕原材料、半成品和成品之間可能出現的交叉污染；同時嚴格區分人員和物品的流通通道，做到人、物的分開流通，杜絕交叉污染。其次，生產設備和器械的消毒。所有的生產設備和器械必須保證無菌。在每次生產前要對所有的操作平臺和生產設備進行徹底的滅菌消毒。其中操作平臺要照射紫外線0.5h以上。所有的生產用具要根據其特性進行相應的高壓滅菌或消毒水浸泡消毒，以確保消毒的徹底。

3.3 嚴格生產操作

強化個人衛生，進入潔凈區域必須進行沖涼和更換無菌工作服，做到潔凈區的生產人員無裸露皮膚暴露在生產環境中。同時在生物制品生產過程中，所有的操作必需規范，杜絕任何小的操作細節，例如操作過程中手離開操作臺、進入操作臺的器械或器皿沒有進行消毒、用手擦汗或接觸到裸露的皮膚可能導致的支原體污染。

4 總結

支原體是一類重要的病原微生物，對人類、豬、牛、禽以及實驗動物等都有致病性。生物制品一旦被支原體污染，就會導致品質下降。由于支原體的污染具有隱蔽性，所以加強生產環節控制和原材料的檢驗，是保證疫苗質量的基礎。

（2011–09–09）

S859.84

C

1007-1733(2012)01-0055-02