高羊茅種子貯藏蛋白的初步分析

魏 明 何 勇 金 強 田志宏

（長江大學生命科學學院 湖北 荊州 434025）

高羊茅（Festuca arundinacea）又名葦狀羊茅，葦狀狐茅，是禾本科羊茅屬（Fescue）多年生叢生草本植物，是冷地型禾本科草種中抗熱抗干旱性最強的草種之一[1]。近幾十年來，高羊茅越來越多的應用于草坪，新品種也逐年增加。如何快速準確地區分這些品種成為草坪工作者共同關注的問題。由于我國除少量的結縷草品種外，其余草種長期以來一直依賴于國外引種[2]，加之國內部分種子經營者片面追求經濟效益而忽視質量，造成國內市場上高羊茅品種混雜、親緣關系不清，給良種保護和新種開發帶來了極大的不便。

在成熟谷類種子中，總蛋白約為種子干重的7%～16%，其中大部分為貯藏蛋白。通常根據蛋白質的溶解性，將種子貯藏蛋白質分為4類：水溶蛋白、鹽溶蛋白、醇溶蛋白和堿（或酸）溶蛋白[3]。禾本科種子中的貯藏蛋白，呈現豐富的多樣性，并且很少受植物生長環境、世代和收獲年限的影響。貯藏蛋白是影響種子品質的因素之一，自Bushuk于1978年提出醇溶蛋白的酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳（A-PAGE）方法以來[4]，種子貯藏蛋白便作為遺傳標記已被廣泛應用于禾谷類作物種、屬間關系、種內遺傳多樣性分析、品種鑒定及植物繁育系統的鑒別[5-10]，但在草坪草的品種鑒定方面卻鮮有報道。

為了滿足我國草坪業的進一步發展需求，本文采用種子貯藏蛋白電泳技術，對市售高羊茅種子進行貯藏蛋白分析，以求從蛋白質水平上探討高羊茅的遺傳多樣性，闡明其種子蛋白水平的遺傳差異，為高羊茅品種間遺傳差異及高羊茅種質資源的分類鑒定提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選用近年來國內市場較為常見的18個高羊茅品種（表1）。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

每個品種取完整籽粒200粒，去穎殼后經粉碎機粉碎，過80目篩，取樣品0.08g裝入1.5mL離心管中，加入樣品提取劑1mL，震蕩5min搖勻。在室溫下放置（水溶蛋白室溫浸提24h，醇溶蛋白室溫浸提12h），再將離心管轉移至沸水浴中煮沸10 min，最后在12000r/min的速度下離心10min，上清液即為種子貯藏蛋白質的提取液，取上清液4℃貯藏備用[11]。

表1 供試高羊茅品種表

1.2.2 電泳

參照農業行業標準《玉米種子純度鹽溶蛋白電泳鑒定方法》（NT/T499-2001）[12]中的乳酸－聚丙烯酰胺凝膠電泳方法，對其進行改進（表2），使用北京六一儀器廠制造的DYY-10三恒型電泳儀和DYY-Ⅲ28B型垂直雙板夾芯式電泳槽，水溶蛋白用50%甘油做提取劑，醇溶蛋白用75%乙二醇做提取劑，不連續SDS-PAGE濃縮膠的濃度為5%，分離膠濃度為12%可以達到最佳的分離效果。濃縮膠、分離膠配方見表2。

表2 凝膠的配制

1.2.3 染色

膠板剝離后，加入至少5倍分離膠體積的固定液（80%甲醇，20%冰乙酸）固定1 h，溴酚藍指示劑由藍色變為黃色后，倒去固定液，蒸餾水沖洗數次，加入與固定液等體積染色液（0.125 g考馬斯亮蘭R-250溶于250 mL固定液）染色3 h以上或40℃染色40 min，倒去染色液，蒸餾水沖洗數次，洗凈凝膠表面殘留染色液[22-24]，（5%甲醇、7.5%冰乙酸）震蕩脫色，每30 min更換一次脫色液，直至背景脫至無色，10%的醋酸溶液中保存或拍照保存。

1.2.4 貯藏蛋白電泳譜帶統計及聚類分析

用0、1表示電泳譜帶的有無，在相同遷移位置上有蛋白質譜帶的記為1，無帶記為0，建立資料數據庫并使用軟件NTSYSpc 2.1進行高羊茅品種聚類分析。

2 結果與分析

2.1 水溶蛋白譜帶分析

18個品種的高羊茅種子水溶蛋白共表現出20條譜帶（圖1、圖2），最多的表現出18條帶，最少的表現出15條帶，但各品種間的條帶差異不大，特異性的條帶不多（圖2）。

圖1 18個品種的高羊茅種子水溶蛋白電泳圖譜

圖2 18個品種的高羊茅種子水溶蛋白電泳圖譜示意圖

2.2 醇溶蛋白譜帶分析

18個品種的高羊茅種子醇溶蛋白共表現出27條譜帶（圖3、圖4），最多的表現出24條帶，最少的表現出11條帶。條帶特異性比較明顯（圖4）。

圖3 18個品種的高羊茅種子醇溶蛋白電泳圖譜條帶

圖4 18個品種的高羊茅種子醇溶蛋白電泳圖譜條帶

2.3 貯藏蛋白譜帶聚類分析

高羊茅貯藏蛋白中的鹽溶蛋白和醇溶蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜，從不同角度反映了供試品種的蛋白質多態性，但進行綜合比較發現用水溶蛋白做聚類分析效果不佳，不能完全區分品種，因此采用醇溶蛋白來做聚類分析。

表3 18個品種的高羊茅遺傳相似性系數

按Nei氏 （1983）公式計算品系間的遺傳相似性系數（GS）（表 3）。 GS＝2Nij/（Ni＋Nj），其中 Ni為材料 i中出現的條帶數，Nj為材料j中出現的條帶數，Nij為材料i和材料j共有的條帶數。遺傳差異即遺傳距離GD=1-GS。遺傳相似系數從 0.3333333到 0.9629630。

以各品種遺傳相似系數為基礎，利用軟件NTSYSpc 2.1中的非加權組法（UPGMA）進行高羊茅品種聚類分析，從圖5看來，以帶型遺傳相似性系數GS＝0.67為度，可將18個供試品種劃分為2個類群：園里、RTF、凌志Ⅱ、千年盛世、雅典娜、踏火、紅寶石、3A、貝殼、愛瑞3號和頂峰聚為一類（類Ⅰ）；時尚、翠碧A、法恩、銳步、火鳳凰、獵狗5號和選手聚為另一類（類Ⅱ）。

圖5 18個品種的高羊茅聚類分析樹狀圖

3 討論

分子生物學研究表明，品種之間的差異主要取決于遺傳物質的差異，蛋白質是基因的產物，可作為品種鑒定的依據[13]。本實驗利用SDS-PAGE對市售的18個品種的高羊茅種子貯藏蛋白進行分析，共得到水溶蛋白譜帶20條、醇溶蛋白譜帶27條，綜合比較后發現各品種間的水溶蛋白譜帶差異不大，特異性的條帶不多，醇溶蛋白譜帶特異性比較明顯，遺傳相似系數從0.3333333到0.9629630，可見在高羊茅品種間有一定數量的種子貯藏蛋白編碼基因的等位變異，同時也表明通過種子貯藏蛋白電泳可對高羊茅的品種鑒定以及育種和種植提供一定的參考，但在育種工作中，尚需要結合不同品種的性狀表現，對這些品種的聚類分析結果給以合理的理解，并將其應用在親本選配中進行生態育種。由于并非所有的基因都編碼或影響種子貯藏蛋白，所以有些重要性狀的遺傳尚需要結合同功酶或DNA譜帶的分析。

在不連續電泳系統中，濃縮膠的存在可濃縮樣品、提高電泳譜帶的分辨率，但減少了分離膠的有效面積和樣品的電泳距離，使電泳譜帶不能很好地加以區分[8]，這種情況在本實驗中也有發生，在進一步的實驗中將根據實際情況做進一步改進，使之更加體現品種鑒定高效、快速的特點。

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