實驗性酒精性肝損傷小鼠血清和肝組織中ACTA及FS的表達水平及其意義

楊 清，李大光，陳 勃，張靈敏，劉 洋，柳忠輝

(1.吉林大學第一醫(yī)院二部輸血科，吉林 長春 130031；2.吉林大學白求恩醫(yī)學院免疫學教研室，吉林 長春 130021)

激活素A(activin，ACTA)屬于TGF-β超家族成員,在初期胚胎形成、神經(jīng)分化誘導、造血細胞增殖和分化、內分泌中樞垂體性激素分泌等多方面發(fā)揮重要作用。ACTA可由巨噬細胞、Th2細胞以及肝實質細胞產(chǎn)生。有研究[1-2]表明：細胞因子在肝纖維化發(fā)病機制中具有重要作用，而激活素是新近發(fā)現(xiàn)參與肝纖維化形成的細胞因子，其中以ACTA最為重要，其以自分泌、旁分泌的形式作用于肝細胞，導致肝細胞增殖抑制、誘導肝細胞凋亡及促進細胞外基質分泌等，參與肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程。卵泡抑素(follistain，F(xiàn)S)具有廣泛的組織分布且與激活素具有高親和力，作為激活素結合蛋白，具有阻斷激活素與其受體結合、中和激活素等多方面的生物學活性[3-4]。目前，關于ACTA和FS在酒精性肝病中的作用，國內外尚未見報道。本文作者擬通過探討ACTA和FS在酒精性肝損傷中的作用，進一步闡明酒精性肝病的發(fā)生機制。

1 材料與方法

1.1 動物及模型建立C57雄性小鼠80只，體質量18～22 g，由吉林大學實驗動物中心提供。適應性喂養(yǎng)3 d后，隨機分為模型組(n=40)和對照組(n=40)。采用酒精灌胃方法制造酒精性肝損傷小鼠模型。選用酒精為北京牛欄山56℃二鍋頭，每日1次按每只小鼠5 g·kg-1酒精量給予。連續(xù)灌胃3 d。對照組小鼠選用蒸餾水連續(xù)灌胃3 d。

1.2 指標檢測選擇小鼠灌胃后24、72、120及168 h 4個時間點，每個時間點分別殺死模型組和對照組小鼠各10只，采集全部血液，37℃水浴30 min，2 000 r·min-1離心15 min，取血清-80℃凍存。其肝組織采用預冷的PBS液100 mL按心臟灌流方法進行清洗，取肝臟在4%多聚甲醛中固定過夜，石蠟切片及抗ACTA及FS染色。結果判定標準：細胞出現(xiàn)棕黃色染色為陽性細胞，無明顯染色細胞為陰性。采用ELISA法檢測小鼠血清ACTA和FS水平，試劑由武漢博生生物公司提供。采用改良賴氏法測定模型鼠和對照鼠血清谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)水平變化，試劑由武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司提供，嚴格按說明書操作。

2 結 果

2.1 2組小鼠血清ALT、AST、ACTA和FS水平變化各時間點對照組小鼠血清ALT、AST和ACTA水平無明顯變化，而模型組小鼠血清ALT、AST和ACTA水平均有不同程度的變化，其中ALT、AST以24 h為最高，ACTA以72 h為最高。模型組小鼠血清ALT、AST和ACTA水平在4個時間點與相應對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。在4個時間點，模型組和對照組小鼠血清FS水平變化無明顯差別，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2 HE染色結果對照組小鼠肝組織肝小葉結構完整，肝細胞大小均勻、排列整齊，無變性壞死，無淋巴細胞浸潤。模型組小鼠末次酒精灌胃后24 h時，肝臟可見明顯的點狀出血壞死，壞死處可見大量的中性粒細胞及淋巴細胞浸潤，局部肝細胞腫脹，胞質疏松；肝組織病變尤以120 h時最為嚴重，結構紊亂，肝小葉內細胞腫脹，胞質淡染疏松，呈氣球樣變。見圖1(插頁一)。

2.3 免疫組織化學染色結果對照組小鼠肝組織中幾乎不表達ACTA，而FS表達陽性。模型組小鼠肝組織中ACTA陽性顆粒分布主要位于中央小葉和門靜脈周圍肝細胞中，并在間質細胞質及其周圍也可見其表達。FS在模型組小鼠肝組織表達與對照組比較無明顯差異。見圖2～4(插頁二)。

表1 不同時間點各組小鼠血清中ALT、AST、ACTA 及 FS水平的變化

3 討 論

激活素是在性腺中發(fā)現(xiàn)的雙鏈糖蛋白，屬于TGF-β超家族成員。大量研究[5-6]證實：激活素是多功能的生長與分化調控因子，與肝臟疾病發(fā)生發(fā)展有關。目前研究最多的是ACTA，肝實質細胞和肝星狀細胞(HSC)均能產(chǎn)生ACTA，以自分泌，旁分泌的方式作用于自身和周圍細胞，參肝細胞活性調節(jié)，與肝臟疾病形成關系最為密切。FS又稱卵泡休止素，是1987年先后從豬和牛的卵泡液中分離獲得的一種新的單鏈糖蛋白，F(xiàn)S具有廣泛的組織分布且與激活素具有高親和力，作為激活素結合蛋白，具有阻斷激活素與其受體結合、中和激活素等多方面的生物學活性。FS作為一種天然拮抗劑參與多種生理、病理功能的調節(jié)，在肝纖維化、肺纖維化、動脈粥樣硬化等疾病的形成中均具有重要的作用[7-9]。本實驗結果表明：正常小鼠肝臟組織低水平表達ACTA和FS，且主要位于肝小葉內門脈區(qū)的肝細胞，在肝損傷過程中ACTA表達升高明顯，而且在肝細胞損傷區(qū)域周圍表達最為明顯，F(xiàn)S在小鼠肝損傷后無明顯變化。因此，在酒精性肝纖維化形成過程中ACTA和FS表達發(fā)生了不同的變化。本研究結果顯示：酒精性肝損傷時ACTA表達明顯增高，在第7天(168 h)時，ACTA水平明顯下降，但依然明顯高于對照組；模型組小鼠血清ALT和AST水平在各時間點均明顯高于相應對照組，以24 h時最高，提示 ACTA水平變化與肝損傷程度相一致。但模型組小鼠血清ALT和AST水平從120 h后又有所升高，這可能與模型鼠肝臟組織免疫反應增強有關，尚待探討。有研究表明：ACTA可能通過抑制肝實質細胞增生，促進間質細胞分泌細胞外基質(ECM)而參與肝纖維化、肝硬變的形成，F(xiàn)S與激活素結合而阻斷激活素生物學效應的發(fā)揮,激活素與FS系統(tǒng)調節(jié)了肝細胞的正常生長，激活素具有抑制作用，F(xiàn)S通過阻斷激活素而發(fā)揮促進作用，這種系統(tǒng)的異常影響細胞正常生長，如肝腫瘤細胞系細胞，這些細胞具有無限制生長特性，在這些細胞中常伴有激活素-FS系統(tǒng)改變。在肝細胞癌細胞系HepG-2中的研究證實：這些細胞有激活素受體表達異常，表現(xiàn)為受體類型減少及與激活素親和力下降，相反FS的分泌無影響[10-14]。本實驗中模型組小鼠FS水平似乎略有升高跡象，是否可考慮為FS對ACTA活性增強的抑制性反應，尚需進一步深入研究。本實驗結果表明：ACTA在酒精性肝損傷過程中起重要作用，激活素-FS系統(tǒng)失衡可能是酒精性肝病、肝纖維化形成的重要原因。

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