基于MEMS微電極芯片的電穿孔系統(tǒng)*

閆 浩，魏澤文，李學(xué)明，趙德堯，梁子才，李志宏*

(1.北京大學(xué)微電子所，微米納米加工技術(shù)國(guó)家級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100871;2.北京大學(xué)深圳研究生院，深圳518055;3.北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)所，北京100871)

細(xì)胞電穿孔(Electroporation)是指細(xì)胞在外加脈沖電壓的作用下，細(xì)胞膜脂雙層上形成瞬時(shí)微孔的生物物理過(guò)程［1］。從1994年第一個(gè)商用細(xì)胞電穿孔設(shè)備發(fā)布以來(lái)［2］，已經(jīng)陸續(xù)報(bào)道了近百種細(xì)胞電穿孔設(shè)備。

然而，目前電穿孔技術(shù)和設(shè)備都存在一些顯著的缺陷［2－5］。傳統(tǒng)技術(shù)加工的電極間距大，而細(xì)胞電穿孔所需的電場(chǎng)較高，這導(dǎo)致現(xiàn)有設(shè)備需要非常高的電壓才能完成電穿孔。高電壓使實(shí)驗(yàn)具有一定的危險(xiǎn)性，而且增加了實(shí)驗(yàn)和設(shè)備成本，更為重要的是由于高電壓引起水電解對(duì)細(xì)胞有極大的損傷［6］。因此，電穿孔效率不高。

為了避免高電壓電穿孔對(duì)細(xì)胞的損傷，提高電穿孔效率，我們研制了基于MEMS工藝的微型電極的細(xì)胞電穿孔芯片［7］。通過(guò)降低電極間距，大大的降低電穿孔所需工作電壓。同時(shí)獨(dú)特的環(huán)形叉指結(jié)構(gòu)，能最大程度優(yōu)化細(xì)胞在芯片上的覆蓋。基于電穿孔電穿孔芯片，我們制作了芯片載具和完整的電穿孔電路系統(tǒng)。

1 設(shè)計(jì)和加工

完整的電穿孔系統(tǒng)包括:電穿孔芯片、芯片載具和電穿孔電路系統(tǒng)。系統(tǒng)的核心是電穿孔芯片，為了更方便的使用電穿孔芯片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，我們?cè)O(shè)計(jì)了芯片載具并且完成了整套電穿孔電路系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)。

1.1 電穿孔芯片

電穿孔芯片是多重圓環(huán)嵌套而成的環(huán)形叉指結(jié)構(gòu)，相鄰兩個(gè)圓環(huán)分別連接不同電極。電穿孔芯片選用金作為電極材料，具有良好的導(dǎo)電性和生物兼容性。

1.2 芯片載具

為了保證每次實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞懸浮液均有同樣體積和細(xì)胞密度，為芯片提供可靠的電學(xué)連接，我們制作了電穿孔芯片載具。

電穿孔芯片載具如圖1所示。它包括用于連接芯片和脈沖發(fā)生裝置的電學(xué)連接件和用來(lái)精密控制細(xì)胞量的盒蓋上方中間凸起的圓柱結(jié)構(gòu)。圓柱結(jié)構(gòu)能對(duì)液體表面的進(jìn)行平整處理，控制細(xì)胞量，提高電穿孔效率。小圓柱在盒子關(guān)閉的時(shí)候和芯片的間距小到幾百微米。芯片載具的材質(zhì)可以為透明材料(圖1(c))或者不透明材料。使用透明的材料可以方便的觀察到細(xì)胞的狀態(tài)。芯片載具包括軸和卡扣，用于盒子的開(kāi)關(guān)和連接。

圖1 (a)電穿孔芯片載具的結(jié)構(gòu)圖，其中電穿孔芯片在載具的正中。(b)(c)為電穿孔芯片載具實(shí)物圖，其中圖(c)為透明材料制作

另外，電穿孔芯片載具能夠承載并保護(hù)芯片。由于生物實(shí)驗(yàn)對(duì)環(huán)境要求較高，做成密封的盒子能夠防止細(xì)胞污染。

1.3 電穿孔電路系統(tǒng)

基于電穿孔芯片和芯片載具，我們?cè)O(shè)計(jì)了完整的電穿孔電路系統(tǒng)。該系統(tǒng)如圖2(a)所示，只需將細(xì)胞導(dǎo)入到芯片上，將芯片載具插入電穿孔系統(tǒng)的插槽中，通過(guò)鍵盤輸入數(shù)據(jù)，即可完成電穿孔。

圖2 用戶只需選擇相應(yīng)的細(xì)胞種類即可，細(xì)胞庫(kù)里包含常用細(xì)胞，也包括原代細(xì)胞和干細(xì)胞

交互界面使用的是320 240點(diǎn)陣的LCD液晶屏。用戶可以采用多種模式的電穿孔，包括手動(dòng)電穿孔和智能電穿孔。手動(dòng)電穿孔可以根據(jù)用戶需要調(diào)整電脈沖參數(shù)，優(yōu)化電穿孔效率。

智能電穿孔時(shí)，用戶使用系統(tǒng)自帶的細(xì)胞庫(kù)，選擇相應(yīng)的細(xì)胞，即可對(duì)相應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行電穿孔。只需要用戶選擇相應(yīng)的細(xì)胞種類，系統(tǒng)將自動(dòng)完成電穿孔參數(shù)的設(shè)置。大多數(shù)現(xiàn)有電穿孔設(shè)備由于受到細(xì)胞狀態(tài)，溶液導(dǎo)電率，系統(tǒng)功率等因素的影響，電穿孔的一致性差，難以用相同條件得到相同結(jié)果。從而無(wú)法使用智能電穿孔模式。我們的電穿孔系統(tǒng)由于精巧的芯片設(shè)計(jì)，能產(chǎn)生更均一的電場(chǎng)，保證每次都能得到優(yōu)秀的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

電穿孔系統(tǒng)的電路部分是基于單片機(jī)STC89C58RD+，結(jié)合模擬和功率放大電路制作而成。系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如圖3所示。用戶通過(guò)鍵盤和顯示模塊輸入電學(xué)參數(shù)。利用單片機(jī)程序的控制，系統(tǒng)可以讀取用戶所需電壓的幅度和脈沖寬度等數(shù)據(jù)，并且產(chǎn)生一個(gè)信號(hào)。該信號(hào)經(jīng)過(guò)一級(jí)放大，二級(jí)放大和功率放大，得到最終的脈沖輸出。存儲(chǔ)模塊用來(lái)存儲(chǔ)用戶添加的數(shù)據(jù)。蜂鳴器發(fā)聲配合按鍵，同時(shí)還可以作為過(guò)流警報(bào)。當(dāng)系統(tǒng)輸出過(guò)大電流時(shí)，過(guò)流保護(hù)模塊能自動(dòng)斷電，以保護(hù)系統(tǒng)安全。

圖3 系統(tǒng)電路結(jié)構(gòu)框圖

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了驗(yàn)證電穿孔系統(tǒng)的性能，我們采用HEK-293A細(xì)胞進(jìn)行GFP(綠色熒光蛋白)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將分離出來(lái)的細(xì)胞，加入緩沖液和GFP質(zhì)粒，滴到電穿孔芯片上，將芯片載具放入所述系統(tǒng)中進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)條件為:脈沖電壓60 V，脈沖寬度0.1 ms，脈沖間隔2 s，脈沖次數(shù)為3。成功電穿孔并表達(dá)GFP的細(xì)胞會(huì)發(fā)出綠色熒光。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4(a)、(b)所示，圖4(a)亮場(chǎng)圖包含所有的細(xì)胞，圖4(b)熒光圖是表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞，即被電穿孔的細(xì)胞。由圖可知，HEK-293A的電穿孔效率高于90%，存活率亦高于80%。

圖4 HEK-293A細(xì)胞的GFP轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

除了向易于被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中輸運(yùn)質(zhì)粒DNA以外，細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)面臨的更大挑戰(zhàn)是向難以被轉(zhuǎn)染細(xì)胞中輸運(yùn)siRNA等大分子。而現(xiàn)有的電穿孔系統(tǒng)都很難完成該種實(shí)驗(yàn)。

為了驗(yàn)證所述電穿孔系統(tǒng)的適用范圍，我們選擇另一種公認(rèn)的難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞3T3-L1(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)進(jìn)行電穿孔實(shí)驗(yàn)［8］。3T3-L1在誘導(dǎo)成脂肪細(xì)胞的時(shí)候會(huì)產(chǎn)生一種MALAT1的非編碼RNA，我們通過(guò)電穿孔導(dǎo)入MALAT1的siRNA對(duì)它進(jìn)行抑制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，在電穿孔后第一天，實(shí)驗(yàn)組中MALAT1的表達(dá)被抑制了80%。這個(gè)結(jié)果表明3T3-L1的電穿孔效率高達(dá)80%。

圖5 3T3-L1的電穿孔實(shí)驗(yàn)

3 結(jié)論

基于電穿孔的微加工芯片，我們研制了完整的電穿孔系統(tǒng)，它能夠提供多種細(xì)胞的高效電穿孔。通過(guò)良好的人機(jī)交互界面，用戶可以很方便的進(jìn)行智能電穿孔和手動(dòng)電穿孔。由于結(jié)合了MEMS微電極芯片，使電穿孔所需的電壓大大降低，因而減小了對(duì)細(xì)胞的損傷。電穿孔的細(xì)胞存活率和電穿孔率都高于所見(jiàn)報(bào)道的結(jié)果。在實(shí)驗(yàn)中，HEK-293A的電轉(zhuǎn)效率達(dá)到90%，3T3-L1的電穿孔效率高達(dá)80%。該電穿孔系統(tǒng)已經(jīng)在北京大學(xué)的幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室里試用，并且做過(guò)大量的電穿孔實(shí)驗(yàn)。系統(tǒng)穩(wěn)定性好，使用方便。

［1］ Neumann E，Schaefer-Ridder M，Y Wang，et al.Gene Transfer into Mouse Lyoma Cells by Electroporation in High Electric Fields［J］.The EMBO Journal，1982，1(7):841.

［2］ Murakami Yuji，Motohashi Ken，Kazuyoshi Yano，et al.Micromachined Electroporation System for Transgenic Fish［J］.Journal of Biotechnology，1994，34(1):35－42.

［3］ siPORTerTM－96 Electroporation Chamber(Cat#13500)Instruction Manual.

［4］ http://www.lonzabio.com/cell－biology/transfection/

［5］ http://zh.invitrogen.com

［6］ Kim J A，Cho K，Shin M S，et al.A Novel Electroporation Method Using a Capillary and Wire-Type Electrode［J］.Biosensors and Bioelectronics，2008，2(12):1353－1360.

［7］ Huang Huang，Zewen Wei，Yuanyu Huang，et al.An Efficient and High-Throughput Electroporation Microchip Applicable for siRNA Delivery［J］.Lab on a Chip，2011，11:163－172.

［8］ Wei Liao，Audrey Nguyen M T，Takeshi Imamura，et al.Lentiviral shRNA-Mediated Knockdown of GLUT4 in 3T3－L1 Adipocytes［J］.Endocrinology，F(xiàn)ebruary 23，2006，10.1210/en.2005－1638.