高效液相色譜法檢測飼料中三唑類殺菌劑殘留

趙春娟 ， 高文惠 *

（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊050018；2.河北省發(fā)酵工程技術研究中心，河北石家莊，050018）

三唑殺菌劑是一種殺真菌劑，是指含有1，2，4-三唑環(huán)的化合物，因具有抗菌作用及調節(jié)植物生長作用，被廣泛應用于水果、蔬菜、谷糧等病蟲害的防治。隨著三唑類農藥的廣泛應用，其在食品、飼料和環(huán)境中的殘留問題也逐漸引起人們的重視。目前，三唑類殺菌劑殘留的檢測一般采用色譜法，如液相色譜法（張敏等，2012）、液質聯用檢測技術（Li等，2012）、氣質聯用檢測技術（Silva等，2013），但同時檢測飼料中4種或4種以上三唑類殺菌劑殘留的研究還鮮見報道。本實驗采用高效液相色譜法同時分離檢測飼料樣品中腈菌唑、戊唑醇、聯苯三唑醇、烯唑醇4種三唑類殺菌劑殘留，以期實現快速、高效的分離分析效果。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 LC-20A高效液相色譜儀 （日本島津公司）、KH5200型超聲波清洗器 （昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）、LD5-2A低速離心機 （北京雷勃爾離心機有限公司）、FA2204分析天平（上海菁海儀器有限公司）。

甲醇、乙腈均為色譜純（天津市光復精細化工研究所），聯苯三唑醇（純度為99%，上海酶聯生物科技有限公司），腈菌唑（純度為97%，鄭州綠康化工有限公司），烯唑醇、戊唑醇 （純度均為98%，北京金寶在線科技有限公司）。

三唑類殺菌劑標準儲備液的配制：分別準確稱取腈菌唑、戊唑醇、聯苯三唑醇、烯唑醇標準品10 mg，各用乙腈溶解并分別定容至50 mL，使用時再根據需要用乙腈稀釋至相應濃度。

1.2 色譜條件 色譜柱：Promosil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）， 檢測波長 210 nm， 流動相為甲醇-水（85∶15，V/V），流速 1 mL/min，柱溫為 30 ℃，進樣量 20 μL。

1.3 樣品前處理 稱取2.5 g樣品，用20 mL乙腈提取（提取兩次，每次 10 mL），超聲 15 min，于4000 r/min離心10 min，合并2次上清液，濃縮，定容至5 mL，用0.45 μm微孔濾膜過濾，待上機測定。

2 結果與討論

2.1 檢測波長的選擇 對腈菌唑、戊唑醇、聯苯三唑醇和烯唑醇分別進行紫外光譜掃描，以確定液相色譜的檢測波長。由圖1可知，腈菌唑、戊唑醇、聯苯三唑醇和烯唑醇的最大吸收波長分別為196、199、214 nm 和 194 nm， 但 甲醇 在 190 ～208 nm有吸收。綜合考慮以上情況，本實驗選擇210 nm為最佳檢測波長。

圖1 腈菌唑、戊唑醇、聯苯三唑醇和烯唑醇的紫外光譜圖

2.2 流動相和流速的選擇 本實驗分別采用甲醇、乙腈、甲醇-水作為流動相，考察洗脫能力。甲醇和乙腈的洗脫能力均很強，4種三唑類殺菌劑不能實現分離，從經濟角度考慮，向甲醇中加入水，采用甲醇-水混合溶劑作為流動相，分別考察了甲醇-水體積比為 95∶5、90∶10 和 85∶15， 流速分別為0.5、0.8、1 mL/min時各三唑類殺菌劑的分離情況。當甲醇-水體積比為95∶5和90∶10時，戊唑醇和聯苯三唑醇不能實現完全分離，后將甲醇-水體積比降到85∶15（V/V）時，戊唑醇和聯苯三唑醇可實現基線分離。然后考察了流速對被測物保留行為的影響，當流速為0.5 mL/min和0.8 mL/min時，被測物出峰時間較長，且峰形較寬；當流速為1 mL/min時，出峰時間明顯縮短，峰形好。故本實驗選擇流動相比例為 85∶15（V/V），流速為 1 mL/min。此條件下4種三唑類殺菌劑的色譜分離情況如圖2所示，9 min內4種殺菌劑實現了基線分離。

圖2 4種三唑類殺菌劑的分離色譜圖

2.3 線性關系和檢測限 移取標準儲備液，配制成濃度為0.05～200 μg/mL的標準混合溶液，在1.2色譜條件下測定，以峰面積對濃度繪制標準曲線。4種三唑類殺菌劑的線性關系和檢測限見表1。

表1 4種三唑類殺菌劑的線性關系及檢測限

由表1可知，腈菌唑的線性范圍為0.15～200 μg/mL，檢測限為 0.05 μg/mL；戊唑醇、聯苯三唑醇和烯唑醇的線性范圍為0.3～200 μg/mL，檢測限為0.1 μg/mL；4種目標物的線性相關系數≥0.9938。

2.4 樣品測定 將雞飼料和豬飼料樣品按照1.3中方法處理，在確定的最佳色譜條件下進行樣品測定。結果顯示，在雞飼料和豬飼料中均未檢出4種三唑類殺菌劑。圖3為典型樣品雞飼料的色譜分離圖。

圖3 雞飼料的色譜分離圖

2.5 加標回收率和精密度實驗 對雞飼料和豬飼料進行低水平和高水平的加標回收率實驗，結果見表2。由表2可知，樣品加標平均回收率（AR）為83.4%～101.2%，相對標準偏差（RSD）＜3.00%。 表明該法回收率和精密度較高，分析方法可行。

表2 飼料樣品中4種殺菌劑回收率和精密度（n=5） %

3 結論

本實驗建立了同時分離檢測飼料中4種三唑類農藥殘留的高效液相色譜法。腈菌唑、戊唑醇、聯苯三唑醇、烯唑醇在9 min內實現了基線分離，4種殺菌劑的線性相關系數≥0.9938，腈菌唑的檢測限為0.05 μg/mL，戊唑醇、聯苯三唑醇和烯唑醇的檢測限為0.1 μg/mL，樣品加標平均回收率為83.4%～101.2%，相對標準偏差＜3.00%。該方法可用于飼料樣品中三唑類殺菌劑殘留的檢測。

[1]張敏，黃其亮，殷帥，等.基于離子液體的分散液相微萃取-高效液相色譜法測定水中三唑類農藥[J].華中農業(yè)大學學報，2012，31（3）：341～345.

[2]Li Y B，Dong F S，Liu，et al.Simultaneous enantioselective determination of triazole fungicides in soil and water by chiral liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A，2012，1224：51～60.

[3]Silva E A S，Lopez-Avila V，Pawliszyn J.Fast and robust direct immersion solid phase microextraction coupled with gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry method employing a matrix compatible fiber for determination of triazole fungicides in fruits[J].Journal of Chromatography A，2013，1313（25）：139～146.