帶菌嫁接工具對西瓜嫁接苗BFB發生的影響及防治方法

牛慶偉 孔秋生 黃遠 別之龍

摘 要： 細菌性果斑病（BFB）是西瓜上的毀滅性病害，西瓜嫁接苗集約化生產過程中容易感染該病害，研究嫁接過程中BFB的侵染途徑及防治方法對于西瓜健康種苗生產具有重要意義。本研究通過人工模擬接種西瓜細菌性果斑病菌pslbtw20，分析了用帶菌竹簽嫁接對西瓜嫁接苗BFB發生的影響，同時研究了不同消毒技術的效果。結果表明，高濃度菌源污染的竹簽嫁接能夠導致嫁接苗BFB的發生，嫁接前采用40% 甲醛50倍液和75% 酒精浸泡帶菌嫁接用具15 min，防效可達到100%。

關鍵詞： 嫁接工具； 竹簽； 細菌性果斑病； 消毒技術； 西瓜嫁接苗

西瓜細菌性果斑病（Bacterial Fruit Blotch）是由燕麥嗜酸菌西瓜亞種（Acidovorax avenae subsp. citrulli）引起的瓜類細菌性果腐病，簡稱BFB，是典型的由種子帶菌引起的傳染性病害，也是我國規定的檢疫性病害之一。BFB從苗期到成株期均可發生，病菌可危害瓜類植物的葉子和果實，引起葉枯和瓜腐，但葉柄、莖、根不受浸染[1]。BFB病菌主要附著在種子和病株殘體上越冬，種子帶菌為主要侵染來源，病菌隨風、雨或灌溉水從植株氣孔或傷口侵入，在病株上大量繁殖擴展， 造成再次侵染[2]。

BFB于1985年在我國首次被發現，目前該病在我國各西瓜產區均有發生。隨著西瓜集約化嫁接育苗技術的普及，越來越多的育苗工廠開始出現BFB的發生與流行。BFB對嫁接苗會造成毀滅性的危害，其所造成的損失和影響遠比其他瓜類病害嚴重。因此，研究嫁接苗生產過程中BFB的侵染途徑及其防治方法，對保護瓜農、育苗生產者的利益和防控西瓜BFB的發生與流行具有重要意義。

嫁接過程中嫁接苗的傷口、污染的刀具和器皿及人為的傳播均會造成病害的流行[3]。Bahar等[4]發現在甜瓜1葉1心期，莖部人工針刺接種BFB病菌，會導致甜瓜幼苗發生BFB，最終腐爛死亡。在西瓜嫁接過程中，需使用竹簽等嫁接工具在砧木上斜插，這也相當于一個接種過程。然而，如果竹簽等嫁接工具帶有病原菌，會不會造成嫁接苗BFB的發生，目前尚不知曉。本研究的主要目的是利用人工接種的方法，分析用帶菌竹簽嫁接與西瓜嫁接苗BFB發生的關系，尋找高效嫁接用具消毒技術，旨在為西瓜嫁接苗健康生產提供技術支撐。

1 材料和方法

1.1 供試材料

砧木和接穗分別選用京欣砧1號（北京京研益農科技發展中心提供）和早佳（84-24，新疆明鑫科鴻農業科技有限責任公司提供）。 西瓜細菌性果斑病菌為pslbtw20，由中國農業科學院植物保護研究所趙廷昌研究員惠贈。供試培養基為KBA培養基（硫酸鎂1.5 g、磷酸氫二鉀1.5 g、瓊脂20 g、甘油10 g、蛋白胨20 g、蒸餾水1 000 mL、pH值7.0～7.2）。嫁接竹簽由武漢洪北種苗有限公司提供。試驗于2012年3月15日至5月1日在華中農業大學校內進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 藥劑室內抑菌和殺菌試驗 挑選西瓜細菌性果斑病菌pslbtw20的單菌落，在KBA液體培養基中28 ℃、220 r·min-1培養，制成菌量約為108 cfu·mL-1的菌懸液。分別用40% 甲醛50倍液、75% 酒精進行西瓜細菌性果斑病菌的抑菌和殺菌試驗。抑菌作用采用紙碟法進行測定[5]，殺菌效果測定按照趙廷昌的方法進行[6]，處理BFB病菌的時間分別為5、10、15 min。

1.2.2 竹簽接菌濃度與西瓜嫁接苗BFB發生的關系 選用濃度為108、107、106、105、104 cfu·mL-1的菌懸液，采用人工蘸取菌懸液的方法對竹簽接菌，無菌水為對照。嫁接方法均采用頂插接[7]，嫁接竹簽蘸1次菌液嫁接1株西瓜苗，共6個處理，3次重復，每個重復18株。在溫室中生長10 d，每天記錄嫁接苗發病率，觀察嫁接苗發病情況。

1.2.3 確定嫁接苗子葉期發病情況的分級標準 根據嫁接苗發病情況并參考Hopkins and Thompson[8]提出的1～9級分級標準，確定竹簽帶菌時嫁接苗子葉期發病情況分級標準，用于計算病情指數。

1.2.4 帶菌竹簽嫁接與西瓜嫁接苗BFB發生的關系 在育苗工廠的嫁接過程中，竹簽需要連續嫁接作業，所以有必要模擬帶菌竹簽在育苗工廠中對嫁接苗的危害情況。選用108 cfu·mL-1左右的菌懸液，嫁接竹簽蘸取菌液1次，然后按順序連續嫁接50株西瓜苗（1個穴盤），重復3次，以不帶菌嫁接竹簽為對照。每天調查嫁接苗發病率并計算病情指數，病情指數參考Amadi等[9]的計算公式：

1.2.5 帶菌竹簽消毒技術對西瓜嫁接苗BFB的防治效果 選用108 cfu·mL-1左右的菌懸液，采用人工蘸取菌懸液的方法對竹簽接菌，分別用40% 甲醛50倍液和75% 酒精浸泡15 min 消毒，消毒后按順序連續嫁接50株西瓜苗，以帶菌竹簽嫁接處理作為對照，共3個處理，每個處理重復3次。第10天調查每株嫁接苗的病情指數和發病率。

2 結果與分析

2.1 2種消毒液對西瓜細菌性果斑病菌的室內抑菌和殺滅效果

室內應用圓形濾紙法測定結果表明，40% 甲醛50倍液對西瓜細菌性果斑病菌有顯著抑菌作用，抑菌圈直徑為16.6 mm，75% 酒精對西瓜細菌性果斑病菌無抑菌作用。室內殺菌試驗結果表明，40% 甲醛50倍液和75% 酒精分別處理西瓜細菌性果斑病菌，無論是處理5、10 min，還是15 min，KBA固體培養都無單菌落存在，殺菌效果達到100%。

2.2 不同帶菌濃度竹簽嫁接對西瓜嫁接苗BFB發病率的影響

竹簽不同帶菌濃度下西瓜嫁接苗BFB發病率見圖1。當嫁接竹簽帶菌濃度為104 cfu·mL-1時，西瓜嫁接苗在嫁接后 10 d內未發生BFB，與對照無差異；當帶菌濃度為105 cfu·mL-1時，嫁接后第7 天開始發病，第10天發病率達到40.7%；當帶菌濃度為106、107、108 cfu·mL-1時，嫁接苗在嫁接后第3天開始發病，第9天發病率達到100%。本試驗結果表明，帶菌竹簽嫁接能夠導致嫁接苗發生BFB，并且帶菌濃度越高，病癥出現的時間就越早，而且發病程度也越嚴重。

2.3 子葉期嫁接苗發病分級標準

2.4 帶菌竹簽連續嫁接對西瓜嫁接苗BFB發生的影響

帶菌竹簽連續嫁接50株西瓜苗，嫁接苗BFB發病率和病情指數的動態變化見圖3。嫁接苗從第3 天開始發病，接穗子葉早期出現水漬狀病斑，后期逐漸轉變為褐色壞死病斑，接穗莖部出現褐色病斑條紋，病情嚴重的導致嫁接苗接穗腐爛枯死，病情指數和發病率隨時間延長不斷加重，第8天嫁接苗發病率達97.3%，第10天嫁接苗病情指數達到88.4，對照嫁接苗沒有發病。

嫁接10 d后，采集2株接穗子葉有明顯病斑的成活西瓜嫁接苗，嫁接苗病原菌分離結果見圖4。不帶菌濃度竹簽嫁接處理，嫁接苗嫁接部位、接穗莖和接穗子葉未能分離得到單菌落，但是在發病嫁接苗的這3個部位均能夠分離到單菌落，挑取疑似單菌落進行PCR檢測，檢測結果見圖5。在16個PCR擴增產物中，15個能夠擴增到BFB細菌的特異性片段，片段長度在250～500 bp，而2.5 竹簽消毒技術對西瓜嫁接苗BFB的防治效果

帶菌嫁接竹簽不同消毒技術對西瓜嫁接苗BFB的防效見表1。帶菌竹簽嫁接50株西瓜苗，嫁接后第10天嫁接苗發病率為97.3%，病情指數 88.4，40%。采用40% 甲醛50倍液和75% 酒精浸泡帶菌竹簽15 min后嫁接西瓜苗，防效達到100%。可見，40% 甲醛50倍液或75% 酒精浸泡帶菌竹簽15 min能夠有效防治竹簽帶菌所導致的嫁接苗染病，消毒效果徹底。

3 討 論

BFB危害在我國各西瓜產區均有報道，西瓜嫁接育苗場感染BFB是造成毀滅性危害的形式之一[12]。接穗種子帶菌是導致嫁接苗感染BFB的主要原因，通過集約化生產途徑使得BFB得以發生蔓延。本研究結果表明，帶菌竹簽嫁接能夠導致嫁接苗發生BFB，并且帶菌濃度越高，病癥出現的時間就越早，而且發病程度也越嚴重。采用帶菌濃度為108 cfu·mL-1的竹簽連續嫁接50株西瓜苗，嫁接苗發病率達97.3%，病情指數達88.4。可見，在嫁接苗集約化生產過程中，被高濃度菌源污染的嫁接竹簽作為BFB病菌的傳播者，能夠導致嫁接苗BFB 發生，對西瓜嫁接苗危害極其嚴重，研究帶菌嫁接工具對嫁接苗BFB發生的影響及其防治方法意義重大。

在嫁接苗BFB的發生與防治研究中，嫁接用具的消毒至關重要，韋志揚[13]曾指出，要嚴格消毒嫁接用具，嫁接的刀具和器皿嫁接前用40% 甲醛50倍液浸泡10 min以上，馬凌珂等[14]指出嫁接用具需用75% 酒精溶液浸泡30 min，但是缺乏試驗證明，目前尚未取得一致認可。本研究采用40%甲醛50倍液或75% 酒精浸泡帶菌嫁接竹簽15 min，消毒處理后嫁接苗BFB發病率為0，消毒效果徹底。

嫁接時帶菌竹簽對砧木的斜插相當于對嫁接苗嫁接部位人工接菌，嫁接部位的Aac如何侵染并導致嫁接苗發病，目前尚不知曉。前人研究結果表明，Aac有單根極生鞭毛，其鞭毛在侵染過程中有重要的作用，IV 型菌毛可幫助病菌定殖和在維管束導管中移動[15]，BFB病菌能夠通過木質部導管向下和向上移動從而系統侵染甜瓜幼苗[4]。本研究結果表明，在發病嫁接苗的嫁接部位、接穗莖和接穗子葉中存在BFB病菌，接穗莖部出現褐色病斑條紋；由此推斷，在嫁接部位的BFB病菌可能通過接穗莖部木質部導管侵染接穗子葉，BFB病菌可以系統侵染西瓜嫁接苗。

4 結 論

在西瓜嫁接苗的工廠化生產過程中，使用高濃度菌源污染的竹簽嫁接能夠導致西瓜嫁接苗BFB的發生，對嫁接苗的危害極其嚴重，采用40% 甲醛50倍液或75% 酒精浸泡帶菌嫁接竹簽15 min，對嫁接苗BFB防效達100%，消毒效果徹底。

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