西瓜甜瓜蔓枯病病菌差異性初步研究

胡鳳云　莫賤友　韋繼光　郭堂勛　黃穗萍　潘朝勃

摘 要： 初步研究了西、甜瓜蔓枯病病菌差異性，為深入了解西、甜瓜蔓枯病病原提供理論依據。采用離體葉片接種法對19個西、甜瓜蔓枯病菌株進行致病力差異性研究，并對不同菌株核糖體基因內轉錄區序列（rDNA-ITS）比較分析。結果發現：不同西、甜瓜蔓枯病菌株致病力存在顯著性差異，病情指數為85.11～4.58；但不同菌株間的ITS序列比較差別不大，保守程度高，菌株間的分化和變異不明顯。

關鍵詞： 西瓜； 甜瓜； 蔓枯病； 病菌差異性

西、甜瓜蔓枯病（Didymella bryoniae）是一種真菌性土傳病害，危害植株莖基部和節間部。由于受保護地特殊生態環境條件以及廣西地區常年高溫高濕氣候的影響，近年來廣西西瓜和甜瓜病害發生種類日益增多，數量越來越大，危害程度越來越嚴重，嚴重影響了西、甜瓜的產量和品質，給瓜農造成了很大的經濟損失。其中，蔓枯病就是西、甜瓜的重要病害之一。據筆者近幾年的調查，在南寧市郊區各西、甜瓜種植基地蔓枯病危害也有加重的趨勢，武鳴縣武帽農場保護地種植瓜類每年種植二、三茬，由于同類作物不斷連作，造成菌源大量積累，同一大棚內春季蔓枯病發病率為20%～30%，秋季發病率在80%～100%，損失在 40% 以上。因此深入研究西、甜瓜蔓枯病病菌差異性，對西、甜瓜蔓枯病防治具有十分重要的現實意義。

1995年Amand等[1]研究了8個蔓枯病菌株對不同葫蘆科作物的致病力，結果顯示基本無差異。2008年吳海波等[2]研究了來自江蘇和海南的4個蔓枯病菌株的致病力，結果顯示差異不顯著。江蛟[3]比較了4個蔓枯病菌株的ITS序列，結果發現菌株之間遺傳多樣性不明顯。本研究即利用離體葉片接種法對西、甜瓜蔓枯病菌株進行致病力差異性研究，并對19個西、甜瓜蔓枯病菌株的ITS序列進行比較分析，以期了解西、甜瓜蔓枯病病菌差異性，不同菌株之間是否存在分化和變異，為深入研究西、甜瓜蔓枯病病原提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

病原菌來源：采自廣西壯族自治區南寧市郊西、甜瓜各種植區及柳州、北海、桂林等地具有典型蔓枯病癥狀的西瓜和甜瓜病株樣本，經分離、純化獲得。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同菌株對同一西瓜品種致病力差異研究

在張永兵等[4]的方法基礎上稍做改進。試驗于2011年9-11月在廣西農業科學院植物保護研究所科研基地及真菌研究室進行。將西瓜種子（西農8號）消毒、播種，出苗后長至3～5片真葉時，取其第3～5 片展開的幼葉，用滅菌蒸餾水沖洗干凈后，晾干葉片表面水分，用軟毛筆將配制好的孢子懸浮溶液（5×105個·mL-1）接種至葉片上，然后將其置于滅過菌鋪有濕濾紙的培養皿中，另設內含不接種病菌只接滅菌蒸餾水葉片的培養皿為對照；在 25 ℃ 條件下進行培養，光照周期為16 h光照/ 8 h 黑暗，相對濕度約90 %。每個處理3片葉，重復3 次。

接種培養3～4 d后，按以下分級標準進行病情級數調查，并計算出病情指數。0級，葉片未發病；1級，葉片發病面積在10% 以下；3級，葉片發病面積 10%～25%；5級，葉片發病面積 26%～50%；7級，葉片發病面積 51%～75%；9級，葉片發病面積 76%～100%。

病情指數按以下公式計算：

1.2.2 不同菌株核糖體基因內轉錄區序列（rDNA-ITS）比較

1.2.2.1 蔓枯病菌菌絲的收集 將不同采樣地點（南寧郊區以及柳州、桂林、北海等地）的19株蔓枯病菌接種于PSA培養基上培養4 d后，接入PD液體培養基中，振蕩培養（25 ℃，80 r·min-1）4～7 d，用滅菌紗布過濾后，用無菌水沖洗2～3次，用濾紙吸干水分，冷凍干燥，低溫保存備用。

1.2.2.2 蔓枯病菌總DNA的提取 采用SDS裂解法[5]，其中稍有改進，具體步驟如下：（1）將單孢分離培養菌株用滅菌移液槍頭把菌絲體從培養基上輕輕刮下，然后挑到已滅菌的2 mL離心管中。（2）挑黃豆粒大小菌絲到一滅菌的2 mL離心管，每管加2顆用無水乙醇灼燒過的鋼珠，加400 μL SDS（十二烷基硫酸鈉）緩沖液；研磨打碎菌絲約20 min，12 000 r·min-1、4 ℃ 離心10 min，取上清液400 μL。（3）加200 μL飽和酚、200 μL氯仿，12 000 r·min-1、4 ℃ 離心15 min，取上清液。（4）加2 μL RNase，37 ℃ 恒溫水浴1 h。（5）加200 μL飽和酚、200 μL氯仿，12 000 r·min-1、4 ℃ 離心15 min，取上清液約350 μL。（6）加上清液2倍體積的無水乙醇（預冷）、1/2體積的3 mL NaOAc（預冷，pH值5.2），輕翻轉混勻，-20 ℃ 凍30 min。（7）12 000 r·min-1、4 ℃ 離心10 min，棄上清液（慢慢倒，小心DNA被倒出），簡單離心，用移液槍吸走多余液體。（8）加100 μL 70% 酒精洗DNA 2～3遍，烘干。（9）加50 μL去離子水（65 ℃ 預熱），混勻，-20 ℃ 保存。

1.2.2.3 核糖體基因內轉錄區序列的PCR擴增及測序 PCR擴增：以ITS1（5-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3）和ITS4（5-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3）為引物，擴增rDNA的ITS1、5.8S和ITS2區域。反應體系含DNA模板1 μL（約10 ng），10×緩沖液（20 mmol·L-1 Tris-HCl， 20 mmol·L-1 KCl） 2.5 μL，Mg2+（25 mmol·L-1 MgCl2） 2 μL，dNTP（共10 mmol·L-1，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5 mmol·L-1） 0.2 μL，引物（ 2 μmol·L-1）各1 μL，Taq酶0.2 μL，加ddH20至25 μL。擴增程序為：94 ℃ 預變性4 min，然后進入循環，94 ℃ 變性30 s，55 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸90 s，共35個循環，最后72 ℃ 延伸10 min。

電泳檢測：取PCR擴增產物5 μL，加入1 μL 6×loading buffer，混勻，點樣于1.5% 的瓊脂糖凝膠（含0.05 μL·mL-1 Goldview）上樣孔中進行電泳檢測（120 V，30 min）。PCR產物委托上海生工生物技術公司測序。

1.2.2.4 蔓枯病菌間rDNA-ITS序列比較 將測序結果放入GenBank數據庫中進行Blast比對，搜索同源性序列。根據這些序列與數據庫中已鑒定出的菌株的ITS序列相似度，從分子水平對收集的蔓枯病菌進行鑒定與比較。將測得的rDNA-ITS序列利用DNAssist version 2.2軟件進行比較，分析菌株之間是否存在遺傳多樣性。

2 結果與分析

2.1 不同菌株對同一西瓜品種的致病力差異

調查發現：致病力強的菌株在西農8號離體葉片上接種1 d 后葉面就出現水漬狀斑點，2 d 后發病率在 50% 以上，侵染處開始褐化，病斑呈不規則形狀沿葉脈擴展。4 d 后發病率高達100 %，許多相鄰病斑擴展連成一片，而對照葉面則未發病。這表明蔓枯病菌的分生孢子可以在離體葉片上正常萌發，并引起葉片發病。離體葉片接種4 d后，葉片出現不同程度感染，19個蔓枯病菌菌株之間病情指數存在顯著性差異，表現出不同的致病力，且絕大多數蔓枯病菌株致病力居中或偏強。其中，WMMK-47、WMMK-10、WTMK-76、WTMK-23等菌株病情指數均較高，致病力較強。而LZMK-34、QXMK-69 病情指數較低，致病力弱（表1）。

2.2 不同蔓枯病菌菌株ITS序列比較分析

對來自不同地區的19個菌株，采用SDS裂解法提取病原菌的總DNA，以提取到的總DNA為模板，采用特異性引物分別擴增出了19個蔓枯病菌菌株的ITS序列。結果如圖1所示，擴增片斷大小在500 bp左右。通過PCR產物測序發現得到的19株蔓枯病菌的ITS序列長度在518～533 bp（圖 1）。

通過Blast比對搜索發現，所測得的19條ITS序列與GenBank數據庫中子囊菌門球殼菌屬 （Didymella Sacc.）的瓜類黑腐球殼菌 Didymella bryoniae 相似度均在98% 以上。而Didymella bryoniae的無性型正是殼二孢屬西瓜殼二孢菌Ascochyta citrullina。該結果進一步從分子角度明確了該菌的分類地位。

采用DNAsist version2.2軟件對測得的19株蔓枯病菌的ITS序列進行比對，結果發現這19株真菌的ITS序列間差別不大，非常保守 （圖2）。

3 討 論

本研究采用離體葉片接種法對不同來源的19個菌株在同一西瓜品種（西農8號）上的致病力進行測定。結果發現不同菌株之間致病力有較大差異，分離獲得的絕大多數蔓枯病菌株致病力居中或偏強。該結果與Amand等[1]和吳海波等[2]的實驗結果有一定的差異，這可能是由于實驗條件不同或選擇的供試品種不同造成的，也有可能是因為存在不同的生理小種，值得進一步探討。

研究表明，測定分析真菌rDNA-ITS序列是進行真菌分類鑒定以及系統發育研究的有效方法之一[6]。目前，真菌 rDNA-ITS序列比對分析已被廣泛應用于許多病原真菌的系統發生上。本研究對19株來源不同的蔓枯病菌的ITS序列進行比對，結果發現這19株真菌的ITS序列間差別不大，非常保守，菌株間遺傳多樣性不明顯。雖然其中15株菌株來自南寧市郊，但BHMK-59、LZMK-34、LZMK-34和GLMK-85分別采集自北海、柳州和桂林地區，采樣地點相距較遠，但地理位置之間的差異并未體現在菌株的遺傳多樣性上。因此認為，廣西地區西、甜瓜蔓枯病菌群分化和變異不明顯，整體上比較單一。

不同蔓枯病菌菌株的致病力存在差異，而又為何未表現在ITS序列上，這可能與所用分析方法等因素有關，也可能是由于真菌的ITS區序列保守程度高，菌株間的微小差異未表現在ITS區序列上，需要結合其他方法（如RAPD、AFLP等）進一步分析菌株的變異性。對此現象，有待作進一步深入研究探討。

4 結 論

本研究發現不同的蔓枯病菌菌株致病力存在顯著性差異，分離獲得的絕大多數蔓枯病菌株的致病力居中或偏強。但不論是不同地理來源和不同致病力的蔓枯病菌菌株之間的ITS序列比較差別不大，說明其ITS區序列的保守程度高，菌株間的分化不明顯。由此可以推測，廣西地區西、甜瓜上的蔓枯病菌群體比較單一，未產生較大的分化和變異。西、甜瓜蔓枯病菌菌株間ITS區序列保守程度高，分析不同菌株間的變異性或差異性，需結合其他方法（如RAPD、AFLP等）進行進一步深入研究探討。

參考文獻

[1]Amand P C，Wehner T C. Eight isolates of Didymella bryoniae from geographically diverse areas exhibit variation in virulence but no isolate by cultivar interaction on Cucumis sativus[J]. Plant Disease，1995，79（11）： 1136-1139.

[2]吳海波，伊鴻平，馮炯鑫，等. 4種甜瓜蔓枯病菌形態特征及其致病力比較[J]. 新疆農業科學，2008，45（1）： 28-30.

[3]江蛟. 甜瓜蔓枯病及抗病材料鑒定研究[D]. 南京：南京農業大學： 2006.

[4]張永兵，王登明，張聰，等. 甜瓜蔓枯病離體接種方法初步研究[J]. 新疆農業科學，2009，46（3）： 521-525.

[5]陳懷谷，方正，陳厚德，等.小麥紋枯病菌核糖體基因內轉錄區序列比較[J]. 植物病理學報，2005，35（1）： 24-29.

[6]Bruns T D，White T J，Tayor J W. Fungal molecular systematics[J]. Annual Review of Ecology and Systematics，1991，22： 525-564.