CD24在人胚腎上皮細胞Hek293中的表達及檢測

敖翔　章清　武強　賀樂奇　張群峰　柯文才　彭志海

[摘要] 目的 構建含有CD24基因的重組質粒，在人胚腎上皮細胞Hek293中表達出具有免疫原性的抗原。方法 用PCR方法擴增CD24基因，克隆到載體pYD5-hFC中，獲得重組質粒pYD5-CD24，轉化DH10α感受態細胞中，挑選克隆抽取質粒，以脂質體介導將質粒轉染Hek293細胞，72 h后收集細胞培養上清，Western-Blot分析鑒定。結果 構建了含有CD24基因的重組質粒，并在人胚腎上皮細胞Hek293中獲得帶有hFC標簽的CD24蛋白。結論 本研究成功表達出了具有免疫原性的CD24蛋白。

[關鍵詞] CD24；表達；Western

[中圖分類號] R741[文獻標識碼] B[文章編號] 1673-9701（2012）29-0047-02

CD24基因編碼唾液酸糖蛋白錨定在細胞表面糖基磷脂酰肌醇鏈上，在成熟的粒細胞和許多B細胞中都有表達[1]，它作為黏附分子對調節腫瘤細胞生長、增殖及侵襲等均具有重要作用[2]，且其高表達及表達模式與患者生存率及預后密切相關，是多種腫瘤有價值的診斷和預后指標[3]。

真核表達系統表達水平高，表達產物可進行翻譯后加工，其抗原性、免疫原性和功能等生物活性與天然蛋白相似等特點，被廣泛應用于各種不同外源基因的表達。本文以真核表達系統表達CD24基因，對表達產物的特異性進行鑒定，并對核蛋白的免疫原性進行初步研究，為CD24基因工程亞單位疫苗的研制及診斷抗原的研究做進一步的探索。

1 材料與方法

1.1材料

CD24模版購自美國open biosysterms公司，DH10α感受態細胞自己制備，限制性內切酶HindIII、BamHI購自NEB公司，T4連接酶、 Taq DNA聚合酶購自美國TAKARA公司，Hek293細胞株、F17培養基、F68、脂質體cellfectine、抽質粒試劑盒均購自invitrogen公司，Anti-CD24鼠抗購自Abcam公司，HRP標記羊抗鼠IgGFc購自Sigma。

1.2 細胞培養

細胞培養參照文獻[4]進行，具體步驟如下，Hek293細胞培養基：F17無血清培養基，培養條件：27℃，5%CO2。懸浮培養：細胞接種到無菌的三角瓶置于恒溫搖床培養，轉速120轉/min，加入1%的F68，懸浮細胞密度一般維持在（0.5×106~1×106）cells/mL之間，一般傳代（2～3）次/周。

1.3 目的基因擴增

根據CD24模板，PCR擴增全長基因。上游引物P1為5GCCGTCTCGGATCCATGGGCAGAGCAATGGTGGC 3，5端加上BamHI酶切位點；下游引物P2為5GCCGTCTCAAGCTTAAGAGTAGAGATGCAGAAGAG 3，5端加上HindIII酶切位點。擴增片斷為240 bp，含有完整的CD24基因，引物由南京金思特科技有限公司合成。

1.4重組質粒構建

將PCR產物CD24經BamHI和HindIII雙酶切，酶切條件：37℃，2 h，酶切產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳分離回收（按說明書操作），回收的目的片段與pYD5載體連接，連接產物pYD5-CD24熱擊轉化大腸桿菌感受態DH10α，涂布LB平板（平板中含有Amp），37℃培養過夜，挑獨立的克隆接種于10 mL LB培養基中（Amp）震蕩培養過夜。

1.5酶切及測序

收集細胞抽質粒進行酶切鑒定，1 mL送測序，1.5 mL保種。若測序正確，將保存菌種擴大培養抽質粒（按Invitrogen公司試劑盒說明書操作）。

1.6細胞轉染及表達分析

轉染在6孔板中進行，當細胞生長密度達到1×106 cells/mL時，利用脂質體（cellfectine）介導轉染，轉染后72 h左右收集細胞培養上清加入 loadingbuffer制得裂解液，根據Western bloting常規操作做WB檢測。一抗：CD24單克隆抗體。二抗：是HRP標記羊抗鼠IgGFc。

2 結果與分析

2.1 目的基因擴增結果

PCR擴增出的CD24基因，經1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一條大約240 bp的特異性條帶，與預期片段大小相符（圖1）。

圖1 CD24的PCR分析

1：2000 marker；2：CD24

2.2 重組質粒鑒定結果

重組質粒pYD5-CD24轉化感受態細胞DH10α，在含有氨芐抗生素的LB培養板上挑取獨立克隆培養，抽出質粒進行雙酶切，酶切結果如圖2。酶切后得到大約6 kb和240 bp兩片段，分別與pYD5載體和CD24基因分子質量一致。測序結果證明載體pYD5和CD24基因接頭連接處正確，大小和讀碼框架正確完整。

2.3 Western bloting分析結果

Western bloting結果如圖3，轉入CD24的Hek293細胞表達得到一條37 kD左右的帶，與預測的37.4 kD相符，說明表達出來的真核蛋白能與CD24單克隆抗體發生免疫反應。

3 結論

研究發現CD24可促進大腸癌細胞的增殖，同時激活Raf-ERK通路及p38MAPK激酶[5]，也與卵巢上皮性腫瘤惡性程度相關[6]，此外與乳腺癌標本中CD44+CD24-細胞E-鈣黏連水平明顯下降[7]。CD24的表達與胃癌腫瘤病理學分級、臨床分期及淋巴結轉移有相關性，同時CD24的異常表達可能與胃癌的早期發生有關[8]。CD24可能與食管鱗癌（ESCC）淋巴結轉移（LNM）相關[9]。樹突狀細胞受脂多糖刺激后CD24表達顯著增高，這有利于DC-T細胞簇的形成及抗原的遞呈，從而導致DC免疫功能的增強[10]。CD24表達可能是反映前列腺癌發生、進展、生物學行為和預后的重要癌干細胞標記物[11]。CD24在病理分級高的胰腺癌中表達高于分級低者，且惡性程度高的原發癌患者CD24表達明顯增強[12]。這些提示CD24在腫瘤的發生發展中扮演著重要角色[13]。

本研究采用真核表達系統在Hek293細胞中表達重組CD24蛋白，真核系統與大腸桿菌等原核表達系統相比，能更好地保持蛋白的免疫原性，且pYD5載體為CD24加入hFC標簽以利于蛋白的純化。用Western Blot方法進行檢測，確定在Hek293細胞中表達出了真核蛋白，分子量約為37.4 kD，與預計的結果相符，且與CD24單克隆抗體發生良好的免疫反應，這表明重組核蛋白保持了天然核蛋白的免疫原性，為進一步研究該蛋白奠定了基礎。

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（收稿日期：2012-09-03）