草胺膦濃度對黃芩植株生長和愈傷組織生長分化的影響

羅翠平　李金華　楊玉穩　曾萬勇

摘要：通過研究除草劑草胺膦對黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）植株生長和愈傷組織生長分化的影響，發現草胺膦對黃芩植株生長和愈傷組織生長分化具有強烈的抑制作用。并在此基礎上找到了合適的草胺膦篩選壓，對于黃芩植株生長是30 mg/L；對于黃芩愈傷組織生長是3.5 mg/L；對于黃芩愈傷組織分化是3.0 mg/L。

關鍵詞：黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）；愈傷組織；除草劑；草胺膦

中圖分類號：Q949.777.6；Q813.1+2 文獻標識碼：A文章編號：0439-8114（2012）20-4529-03

草胺膦（Glufosinate-ammonium）又稱草丁膦，是廣譜滅生性的有機磷類除草劑，其毒性低、活性高、用量少、環境壓力小、使用安全方便。草胺膦的活性成分為（RS）-2-氨基-4-（羥基甲氧瞵基）丁酸銨（Phosphinothricin，PPT）。PPT能通過抑制植物體內惟一解氨毒的谷氨酰胺合成酶（GS）活性，抑制細胞內氨的同化作用，從而導致氨的迅速積累，最終引起葉綠體解體、細胞死亡[1-4]。該除草劑有2種同分異構體，其中D型不具除草劑活性，L型（L-PPT）是主要活性成分[5]。

草胺膦抗性基因bar是目前作物轉基因中用得最多的抗除草劑選擇標記基因之一，具有快速、簡便、高效等優點已成功地用于大豆、小麥、水稻、玉米、大麥、甜菜、棉花、油菜等作物[6]。bar基因能消除PPT對植物體的毒害作用，它編碼草胺膦乙酰轉移酶PAT，使乙酰輔酶A與草胺膦游離氨基結合，形成AC-PAT復合物，使草胺膦失去活性，從而使植株具有草胺膦抗性[7]。因此，對種植的含有bar基因的作物田間噴施PPT，能有效地防除雜草，減少除草劑用量及其在土壤中的殘留，生產成本明顯降低，國外已大面積推廣種植[8]。到目前為止，在人食用和動物飼養方面尚未出現副作用[9]。以bar基因構建的轉基因載體轉化宿主細胞后，只要在選擇培養基中加入一定量的除草劑，就能殺死非轉化細胞，生存下來的就是含有目的基因的轉化細胞，故能迅速、簡便、有效地檢測轉基因植株，減少假陽性植株，進而降低了鑒定轉基因的工作量[10]。

黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）為唇形科黃芩屬植物，其藥用部位為干燥根，具有清熱燥濕、涼血安胎、瀉火解毒的功效，是中國傳統的重要大宗中藥材。對黃芩生物技術的研究有助于黃芩產量和品質的提高。試驗研究了不同濃度草胺膦對黃芩植株生長和愈傷組織生長分化的影響，并據此確定合適的篩選壓，為bar基因作為選擇標記基因的黃芩基因轉化試驗打下了基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料與試劑黃芩種子由中國中醫科學院中藥研究所黃璐琦實驗室提供，植株為種子無菌發芽長成的黃芩無菌苗，愈傷組織為黃芩無菌苗莖段誘導所得。分析純草胺膦購自Sigma公司，其他試劑均為國藥集團化學試劑有限公司的滬試牌分析純試劑。

1.1.2培養基以MS培養基為基本培養基。愈傷組織繼代培養基：MS+30.0 g/L蔗糖+7.0 g/L瓊脂粉+0.1 g/L肌醇+0.3 g/L水解酪蛋白+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；愈傷組織分化培養基：MS+30.0 g/L蔗糖+7.0 g/L瓊脂粉+0.1 g/L肌醇+0.3 g/L水解酪蛋白。按試驗方法添加不同濃度的草胺膦，高壓滅菌前調至pH 5.8～6.0，于121 ℃高壓滅菌18 min，冷凝后待用。

1.2方法

1.2.1草胺膦對植株生長的影響把濃度為0、5、10、15、20、30 mg/L的草胺膦稀釋液分別涂抹在黃芩植株的葉片上，接在MS培養基上，將不涂草胺膦的設為對照，置于25 ℃培養室中，以15 h/d光照培養，1個月后觀察草胺膦對黃芩植株生長的影響。

1.2.2草胺膦對愈傷組織生長的影響選取生長疏松的淡綠色黃芩愈傷組織分別接種在草胺膦濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/L的繼代培養基上，每種濃度梯度的培養基接種6瓶，每瓶接入7粒愈傷組織。置于25 ℃培養室中，以15 h/d光照培養，1個月后觀察記錄愈傷組織的生長、褐化和死亡情況。

1.2.3草胺膦對愈傷組織分化的影響將繼代培養且生長疏松的淡綠色愈傷組織分別接種在草胺膦濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/L的分化培養基上，每種培養基接種6瓶，每瓶接入7粒愈傷組織。置于25 ℃培養室中，以15 h/d光照培養，觀察愈傷組織的分化情況。培養2～3周后，統計愈傷組織的分化率。

2結果與分析

2.1草胺膦對黃芩植株生長的影響

接種植株一月后觀察植物的外觀性狀。由表l可知，黃芩植株對草胺膦有一定的天然耐受性。在草胺膦濃度低于10 mg/L時，植株生長基本不受影響；當濃度達到10 mg/L，葉片開始出現枯斑；當草胺膦濃度達到30 mg/L，葉片才完全枯死。因此在進行黃芩轉bar基因抗性植株的篩選時，草胺膦的濃度應該大于30 mg/L，以避免假陽性植株的出現。

2.2草胺膦對愈傷組織生長的影響

由表2可知，在加有除草劑草胺膦的培養基上，愈傷組織增殖率明顯下降，隨著除草劑濃度的升高，愈傷組織褐化率也相應增高，大多數愈傷組織直接褐化死亡；存活的愈傷組織疏松程度逐漸降低，增殖受到影響。當草胺膦濃度為1.0 mg/L時，愈傷組織的褐化率只有23.8%；當草胺膦濃度上升至4.0 mg/L時，愈傷組織的生長受到了明顯的抑制。沒有分化的愈傷組織褐化壞死。當草胺膦濃度為3.5 mg/L時，褐化率為95.2%，是較為合適的篩選濃度。

2.3草胺膦對愈傷組織分化的影響

為了進一步確定草胺膦對黃芩愈傷組織分化的影響，挑取各種濃度草胺膦下未褐化死亡的細胞進行再分化，由表3可知，當草胺膦濃度為3.0 mg/L時，尚有極少數愈傷組織能形成綠點，并最終形成幼苗，當草胺膦濃度大于3.0 mg/L時，卻沒有綠點形成，也沒有苗形成。可見3.0 mg/L草胺膦對黃芩來說已經是有效的抑制分化濃度了，故在進行黃芩轉bar基因抗性愈傷組織分化的篩選時，草胺膦的濃度以3.0 mg/L較為合適。

3討論

草胺膦是一種非選擇性除草劑，具有殺草譜廣、低毒、內吸好、活性高和環境相容性好等特點，也是全球第二大轉基因作物耐受除草劑，應用前景十分廣闊[11]。不同植物對草胺膦的耐受性不同。在植物轉基因試驗過程中，需要研究目標植物對該除草劑的耐受性。

試驗結果顯示除草劑草胺膦對黃芩愈傷組織的抑制作用遠大于對植株的作用。對愈傷組織，草胺膦濃度為3.0～3.5 mg/L可以有效抑制愈傷組織的生長分化；而對黃芩植株，草胺膦的濃度則需達30 mg/L才可以完全抑制其生長。因此，在進行黃芩轉bar基因抗性植株的篩選時，草胺膦的濃度應該大于30 mg/L。

草胺膦對愈傷組織的生長和分化均有強烈的抑制作用。從試驗結果可以看出，草胺膦對黃芩愈傷組織的分化比對愈傷組織的生長具有更強的抑制作用，在同一種草胺膦濃度下，愈傷組織分化的褐化速率大于愈傷組織生長的褐化速率；草胺膦對愈傷組織分化的篩選濃度3.0 mg/L小于愈傷組織生長的濃度3.5 mg/L。

對轉化后的愈傷組織，選擇培養時篩選臨界濃度的選擇至關重要，太高可能導致愈傷組織大量死亡，太小又容易出現假陽性。因此在做轉化試驗時，可根據篩選臨界濃度和愈傷組織生長狀態來確定草胺膦的使用濃度。

參考文獻：

[1] 黎垣慶，劉剛，嚴文貴，等. 除草劑（草丁膦）抗性基因的遺傳與利用[J].植物學報，1999，41（12）：1348-1350.

[2] 段發平，粱承鄴，黎垣慶.Bar基因和轉bar基因作物的研究進展[J].廣西植物，2001，21（2）：166-172.

[3] ZELDIN E L，JURY T P，SERRES R A，et al. Tolerance to the herbicide glufosinate in transgenic cranberry （Vaccinium macrocarpon Ait.） and enhancement of tolerance in progeny[J].Journal of the American Society for Horticultural Science，2002，127（4）：502-507.

[4] 楊逢玉，張宏軍，倪漢文. 滅生性除草劑草胺膦的作用機理及其應用[J]. 北京農學院學報，2002，17（4）：100-105.

[5] DROGE-LASER W，SIEMELING U，PUHLER A，et al. The metabolites of the herbicide L-phosphinothricin （Glufosinate）[J]. Plant Physiology，1994，105（1）：159-166.

[6] 蘇少泉. 轉基因抗除草劑作物品種的現狀與展望[J]. 世界農業，1998（8）：21-33.

[7] 楊竹平，胡水金，周興良. 生物技術與可持續農業[M].上海：上海科學技術文獻出版社，2000.

[8] 蘇少泉. 抗除草劑油菜在加拿大的發展[J].世界農業，2005（9）：43-44.

[9] HEROUET C，ESDAILE D J，MALLYON B A. Safety evaluation of the phosphinothricin acetyltransferase proteins encoded by the pat and bar sequences that confer tolerance to glufosinate-ammonium herbicide in transgenic plants[J]. Regulatory Toxicology and Pharmacology，2005，41（2）：134-149.

[10] 騫宇. 除草劑“Basta”對油菜植株和愈傷組織的生長分化的影響[J].重慶教育學院學報，2007，20（3）：14-16.

[11] 華乃震，華純. 非選擇性除草劑的進展和應用（下）[J].現代農藥，2011，10（3）：7-11.