HPLC法測定腎石通顆粒中槲皮素的含量

羅愛勤 陳澤鋒

（廣州漢方現代中藥研究開發有限公司，廣東 廣州 510240）

HPLC法測定腎石通顆粒中槲皮素的含量

羅愛勤 陳澤鋒

（廣州漢方現代中藥研究開發有限公司，廣東 廣州 510240）

目的：建立高效液相色譜法測定腎石通顆粒中槲皮素含量的方法。方法：采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(200mm×4.6mm)，柱溫30℃，流動相為甲醇-水(50∶50)，流速1.0mL/min，檢測波長360 nm。結果：槲皮素在0.090 4～0.904 0 μg范圍內質量與峰面積積分值呈良好線性關系，平均回收率98.8%，RSD=1.71%。結論：該法靈敏、準確，可作為腎石通顆粒的質量控制方法。

高效液相色譜法；腎石通顆粒；槲皮素；含量測定

腎石通顆粒是由金錢草、王不留行（炒）、萹蓄、瞿麥、海金沙、丹參、雞內金（燙）、延胡索（醋制）、牛膝、木香等 10味中藥制成，具有清熱利濕、活血止痛、化石、排石的功效，用于腎結石、腎盂結石、膀胱結石、輸尿管結石。收載于《中華人民共和國衛生部藥品標準》（中藥成方制劑第二冊）。該標準中只有性狀、顆粒劑檢查項，尚未建立含量測定項。金錢草和萹蓄為方中主藥，均含有槲皮素，高效液相色譜法（HPLC）測定槲皮素的含量已有文獻[1-5]報道。本研究依照上述文獻開展實驗，結果證明用磷酸溶液的流動相pH值很小，約為2[6]，供試品溶液含鹽酸pH值也約為2，長時間運行后，容易損耗色譜柱和高效液相設備。因此，在已有文獻報道HPLC法的基礎上，對色譜條件和供試品溶液的制備方法加以改進，建立了HPLC測定腎石通顆粒中槲皮素含量的方法。該法靈敏、快速、準確、重現性好，可有效控制該制劑質量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100 Series高效液相色譜儀；依利特十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱 (200 mm×4.6 mm，5 μm)。

1.2 試藥

腎石通顆粒及陰性樣品 （廣州漢方現代中藥研究開發有限公司）；槲皮素對照品（原中國藥品生物制品檢定所，批號為100081-200406），甲醇（色譜純），水為蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 色譜條件與系統適應性試驗

2.1 色譜條件

依利特十八烷基鍵合硅膠色譜柱 (200 mm× 4.6 mm，5 μm)，柱溫30℃，流動相甲醇-水（50∶50），流速1.0 mL/min，檢測波長360 nm。理論板數按槲皮素峰計算不低于2 000。

2.2 系統適用性試驗

分別精密吸取槲皮素對照品溶液、供試品溶液、陰性溶液各10 μL注入高效液相色譜儀，測定，色譜圖見圖1。槲皮素的保留時間約為19 min，與其他組分分離良好（分離度大于1.5）陰性溶液色譜圖在槲皮素峰位置無干擾。

圖1 高效液相色譜圖A對照品 B供試品C缺金錢草、萹蓄陰性溶液

3 對照品溶液的制備

精密稱取槲皮素對照品適量，加甲醇制成每1 mL含槲皮素0.05 mg的溶液，即得。

4 供試品溶液的制備

取本品約20 g，研細，精密稱定，加水100 mL，加熱回流1.5 h，離心，濃縮至10 mL，加乙醇40 mL，攪拌，靜置30 min，濾過，濾液蒸干，用水20 mL使溶解，加鹽酸 4 mL，加熱回流水解1 h后，放冷，用乙酸乙酯振搖提取3次，每次24 mL，合并乙酸乙酯提取液，用水洗滌3次，每次70 mL，乙酸乙酯液蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉移至5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

5 陰性溶液的制備

取缺金錢草、萹蓄的陰性樣品，按4項下方法制備，即得。

6 方法學考察

6.1 線性關系考察

分別精密吸取含量為0.045 2 mg/mL槲皮素對照品溶液2、4、6、8、10和20 μL進樣。以峰面積A（mAU*s）對槲皮素峰的質量數C（μg）回歸，結果見表1和圖2。

表1 槲皮素標準曲線的繪制

圖2 槲皮素標準曲線

回歸方程

相關系數r=0.999 9。

以上結果表明槲皮素在0.090 4～0.904 0 μg范圍內，與峰面積積分值呈良好線性關系。

6.2 精密度試驗

精密吸取槲皮素對照品溶液10 μL，連續重復進樣6次，記錄峰面積分別為：543.8587、532.9718、544.747 3、539.142 7、541.521 1、543.615 5，得平均峰面積值為540.976 2，計算RSD=0.82%，表明本測定法精密度良好。

6.3 穩定性試驗

取同一供試品溶液，分別在 0、1、2、4、6、8 h進樣10 μL測定，以峰面積計算得槲皮素的峰面積RSD分別為0.63%（n=6），表明供試品溶液中槲皮素在 8 h內穩定[7-9]。

6.4 重復性試驗

取同批供試品（110701-1）6份，研細，精密稱定，按4項下方法制備，進樣10 μL測定，測得槲皮素0.006 mg/g，RSD為2.25%（n=6），表明本法具有良好的重復性。

6.5 準確度試驗

采用加樣回收法，取已知含量樣品(110701-1)，研細，精密稱取6份，每份10 g，分別置6只具塞錐形瓶中，精密加入含槲皮素對照品0.06 mg/mL的對照品溶液 1 mL，按 4項下方法制備，進樣10 μL測定，測得槲皮素回收率98.80%，RSD= 1.71%（n=60）。

7 樣品測定

取3批樣品 (110701-1、110821、110822)及另外5個廠家市售的腎石通含糖顆粒，按4項下方法制備，分別精密吸取10 μL注入液相色譜儀，測定樣品中槲皮素的含量，結果見表2。

表2 腎石通顆粒槲皮素含量

8 討論

本測定法中的流動相，用水替代了磷酸溶液，結果表明加磷酸對槲皮素的峰形和保留時間影響不大，因此，本研究把流動相設為甲醇-水[10]混合溶液。另外還比較了不設柱溫和柱溫設為30℃[11]槲皮素峰的保留時間，發現柱溫設為30℃時，槲皮素在12 h內保留時間穩定，而不設柱溫，槲皮素保留時間不穩定。

槲皮素在冷水中幾乎不溶，由于顯弱酸性，在冷的酸水中的溶解度很小。槲皮素能溶于乙酸乙酯和正丁醇等與水不相溶的溶劑，因此，在研究供試品溶液制備方法過程中，用乙酸乙酯提取槲皮素，用水飽和正丁醇提取剩余溶液以檢驗乙酸乙酯的提取是否完全。結果顯示用乙酸乙酯提取3次后，乙酸乙酯層溶液接近無色，接著用水飽和正丁醇提取不出槲皮素，說明乙酸乙酯已經提取完全。用蒸餾水洗滌乙酸乙酯溶液，洗滌至3次即能達到中性，且槲皮素無損失。

此外，本研究還對供試品溶液的提取方法(加熱回流、超聲、微波提取[12]等)，提取溶劑(水、甲醇、65%乙醇、乙醇等)，溶劑的量，提取時間，水解前加水量，加酸量和水解時間等進行了考察，從而得出供試品溶液制備方法，該法其他成分干擾少，分離度令人滿意。

本研究建立的HPLC測定槲皮素含量的方法穩定性、重復性好，精密度、回收率都較滿意，能有效控制腎石通顆粒的質量。

[1] 吳戌，秦英，石寧.高效液相色譜法測定腎石通顆粒中槲皮素的含量[J].中國新醫藥，2003，2（10）:30-32.

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Content Determination of Quercetin in Shenshitong Granules by HPLC

Luo Aiqin，Chen Zefeng(Guangzhou Hanfang Pharmaceutical Co，Ltd.，Guangdong Guangzhou 510240，China)

Objective:To develop a method for the content determination of quercetin in Shenshitong Granules by HPLC.Methods:Chromatographic column(200 mm×4.6 mm)of octadecylsilane chemically bonded silica was used.The column temperature was at 30℃，the mobile phase was methanol-water(50∶50)，the flow rate was 1.0 mL/min，and the detection wavelength was at 360 nm. Results:There was a good linear relationship between the quality and peak area integral value in the range of 0.090 4～0.904 0 μg for quercetin.The average recovery rate was 98.8% (RSD=1.71%).Conclusion:The method is sensitive，accurate and can be used for quality control of Shenshitong Granules.

HPLC；Shenshitong Granules；Quercetin；Content Determination

10.3969/j.issn.1672-5433.2012.03.005

2011-11-08）

廣東省科技計劃項目——以動態逆流提取和納濾濃縮為核心的高效節能成套技術及裝備的開發（2009A030901008）

羅愛勤，女，制藥工程師，執業藥師。研究方向：中藥新藥和保健食品。E-mail：aiqin1114@163.com