草木樨中香豆素類化合物的研究進(jìn)展

湯春妮，樊 君

(1.陜西國防工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，陜西 西安 710302；2.西北大學(xué)化工學(xué)院，陜西 西安 710069)

草木樨(Melilotus)為豆科(Leguminosae)一年生或二年生草本植物，主要分布在中亞、北非和歐洲等地，我國也有大面積種植，主要為黃花草木樨和白花草木樨。草木樨含有多種活性成分，如香豆素類、黃酮類、酚酸類、甾體類、三萜類、糖類等[1]。研究表明，草木樨香豆素作為主要的藥效成分，具有很強(qiáng)的抗炎、鎮(zhèn)痛、消腫、改善血管通透性、抗菌、抗病毒等藥理作用[2～4]，國外已有產(chǎn)品上市，如消脫止-M(草木樨流浸片、草木樨流浸液)[5]等，而國內(nèi)草木樨香豆素的開發(fā)利用業(yè)已開始。作者在此綜述了草木樨中香豆素類化合物的化學(xué)成分、含量測定、提取純化工藝、藥理作用等方面的研究進(jìn)展，并展望了其應(yīng)用前景。

1 化學(xué)成分

草木樨中香豆素類化合物是以香豆素(苯并α-吡喃酮)為母核的天然產(chǎn)物，多以游離態(tài)或與糖結(jié)合成甙的形式存在，常在3,4,6,7位有取代基。國外有報(bào)道稱黃花草木樨中香豆素(Coumarin)的比例占其總香豆素類化合物的89％以上[6]。而國內(nèi)李靜[1]研究表明黃花草木樨中香豆素的比例占總香豆素類化合物的80％以上。草木樨中香豆素類化合物的結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 草木樨中香豆素類化合物的結(jié)構(gòu)式

R1=R2=R3=R4=H，擬雌內(nèi)酯(Coumestrol) R1=R2=R3=H，R4=CH3，4′-鄰甲基擬雌內(nèi)酯(4′-o-Methycoumestrol) R1=R2=H，R3=OCH3，R4=CH3，7-羥基-4′,5′-二甲氧基擬雌內(nèi)酯(7-Hydroxy-4′,5′-dimethoxy-coumestrol) R1=H，R2=OH，R3=R4=H，Melimessanol A

2 含量測定

由于草木樨原料成分復(fù)雜，故其粗提物中香豆素類化合物的含量測定通常先分離再測定。其測定的對照品均為香豆素，測定依據(jù)為香豆素的紫外特征吸收(香豆素類化合物中含有的吡喃酮和苯環(huán)結(jié)構(gòu))或顯色后的可見光吸收。目前，測定草木樨香豆素含量的方法有薄層掃描法、分光光度法、液相色譜法等，其中高效液相色譜法應(yīng)用最廣。

2.1 薄層掃描法

孫居民等[7]先用硅膠GF254板、冰乙酸∶甲苯(1∶5)展層劑分離草木樨乙醚粗提物后，再用薄層層析掃描儀(配TR-85-1型紫外檢測儀)雙波長掃描(λS=270 nm、λR=325 nm)定量測定草木樨中香豆素含量(回收率98％～105％)。烏云等[8]用硅膠GF254板、石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸(20∶10∶0.1)展層劑分離草木樨乙醚粗提物后，在薄層色譜掃描儀上用單波長掃描(273.5 nm)測定草木樨中香豆素含量(回收率98.37％)。

2.2 分光光度法

劉福林等[9]將草木樨提取物(用乙醚、NaOH堿液結(jié)合乙醇提取)用TLC分離提純后，加2％ Na2CO3和重氮化試劑(對硝基苯胺溶液和亞硝酸鈉溶液，臨用前混合)顯色，用721-2型分光光度計(jì)在490 nm下通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定香豆素含量。李瑜等[10]利用香豆素在堿性(10％氫氧化鉀)條件下與胺(7％鹽酸羥胺)作用后再與Fe3+(10％三氯化鐵)作用生成紫紅色物質(zhì)，在570 nm下用721型分光光度計(jì)測定草木樨香豆素含量。研究表明，當(dāng)草木樨香豆素提取物純化至80％以上時(shí)，可采用紫外分光光度法(檢測波長310 nm，外標(biāo)法)直接測定香豆素含量，與HPLC法[11]測定結(jié)果基本一致。

2.3 液相色譜法

張興福等[12]用DIONEX液相系統(tǒng)、天河-C18柱(250 mm×4.6 mm，10 μm)，檢測波長273 nm，以1.0 mL·min-1的乙腈-水-冰醋酸(20∶80∶1)為流動相，按外標(biāo)法測定了70％乙醇熱回流提取的草木樨中香豆素的含量。歐洲藥典(第五版)[13]中用R-C18柱，檢測波長275 nm，以1.7 mL·min-1的乙腈- 5 g·L-1磷酸水溶液(22∶78)為流動相，測定了草木樨的甲醇回流提取物中香豆素含量。Martino等[14]采用LiChrosorb RP-18柱(250 mm×4.6 mm，7 μm)，用0.7 mL·min-1的0.01％ Ortophosphoric 酸的水溶液、甲醇和乙腈進(jìn)行梯度洗脫，檢測波長275 nm，測定了微波、超聲、索氏3種方法提取的草木樨中香豆素含量。鄭國華等[15]用DIONEX色譜儀，Agilent Eclipse XDB-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，檢測波長273 nm，以1.0 mL·min-1的乙腈-0.3％磷酸(35∶65)為流動相，測定了超聲、索氏、回流3種方法提取的草木樨中香豆素含量。高成富等[16]用Agilent 1100 分析型HPLC，YWG-C18柱，檢測波長276 nm，以1.0 mL·min-1的乙腈-水-甲酸(23∶77∶0.2)為流動相，柱溫25 ℃，測定了乙酸乙酯熱回流提取的草木樨提取物中香豆素含量。朱宏[11]用Agilent XDB-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，檢測波長310 nm，以1.0 mL·min-1的甲醇-水(65∶35)為流動相，柱溫35 ℃，測定了80％乙醇超聲法提取的草木樨中香豆素含量。

3 提取純化工藝

3.1 提取工藝

高成富[17]以甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚、丙酮、正丁醇為溶劑，采用加熱回流提取、索氏提取、超聲提取、超臨界萃取等方法提取草木樨，制成草木樨浸膏。例如，稱取粉碎成粗粉的藥材，用10倍量乙酸乙酯熱回流提取3次，每次1 h，合并提取液后減壓濃縮，濃縮液置于80 ℃烘箱烘干得提取物。

3.2 提取純化工藝

3.2.1 熱回流提取-大孔樹脂純化工藝

陶君彥等[18]的提取純化工藝為：用50％乙醇溶液熱回流提取黃花草木樨原料，提取液經(jīng)9倍濃縮，濃縮液用YWD07D1大孔樹脂吸附，80％乙醇洗脫，洗脫液減壓濃縮，烘干得產(chǎn)品。該方法制得的產(chǎn)品中香豆素含量為50％，但此工藝粗提液未經(jīng)處理就直接用大孔吸附樹脂吸附，容易堵塞、污染樹脂，樹脂的處理量較小(僅為58 mg·g-1)。

3.2.2 熱回流提取-脫色-萃取-大孔樹脂純化工藝

朱宏[11]的提取純化工藝為：用80％乙醇溶液熱回流提取黃花草木樨原料，提取液經(jīng)3倍濃縮，濃縮液用石油醚脫色后，用氯仿萃取，萃取液用LSA-40大孔樹脂吸附，70％乙醇洗脫，洗脫液減壓濃縮，烘干得產(chǎn)品。該方法制得的產(chǎn)品中香豆素含量為30％～50％，純化過程中香豆素保留率較低、樹脂處理量較小。

3.2.3 熱回流提取-萃取-大孔樹脂純化工藝

湯春妮[19]的提取純化工藝為：用50％乙醇溶液熱回流提取黃花草木樨原料，將提取液濃縮至香豆素濃度為0.2 mg·mL-1，濃縮液用乙酸乙酯萃取，再用HPD 300大孔樹脂吸附，50％乙醇洗脫，洗脫液減壓濃縮，結(jié)晶，烘干得產(chǎn)品。該方法制得的產(chǎn)品純度可達(dá)97％以上，其樹脂吸附量約475.02 mg·g-1干樹脂。

3.3 消脫止-M的部分生產(chǎn)工藝

日本生晃榮養(yǎng)藥品株式會社公布的消脫止-M(草木樨流浸片、草木樨流浸液)的部分工藝[20]為：用50％乙醇溶液浸提黃花草木樨原料，提取液經(jīng)5倍濃縮，濃縮液經(jīng)純化后(此部分工藝未見公布)，添加麥芽糊精和二氧化硅微粒，噴霧干燥得產(chǎn)品。該工藝制得的產(chǎn)品中主要藥效成分香豆素的含量為20％。

4 藥理作用及應(yīng)用現(xiàn)狀

4.1 抗炎、鎮(zhèn)痛作用

Plesca-Manea等[21]研究表明，含有0.25％香豆素的草木樨提取物與氫化可的松鈉具有類似的抗炎作用，其抗炎機(jī)理可能是草木樨提取物減少了循環(huán)吞噬細(xì)胞的激活和瓜氨酸的產(chǎn)生。F?ldi-B?rcs?k等[22]研究表明，小鼠靜脈注射12.5～100 mg·kg-1的香豆素，結(jié)果表現(xiàn)出與劑量直接相關(guān)的抗炎、消腫的功效；皮下注射草木樨香豆素提取物可減輕甲醛引起的老鼠后爪水腫癥狀。高成富[17]研究發(fā)現(xiàn)草木樨香豆素提取物對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的抗炎鎮(zhèn)痛效果非常好。近年來，日本生晃榮養(yǎng)藥品株式會社生產(chǎn)的消脫止-M(草木樨流浸片、草木樨流浸液)的主要成分為香豆素(香豆素含量不低于20％)，用于痔和皮膚擦傷的治療，效果良好。

4.2 改善血管通透性、改善血液循環(huán)

Zoltán等[23]采用含有1 mg·mL-1香豆素的黃花草木樨提取物制成的制劑Esberiven給小鼠肌肉注射，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其能通過阻止淋巴腦病引起的神經(jīng)條件反射遲緩而保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)。F?ldi等[24]研究發(fā)現(xiàn)草木樨中分離的香豆素(主要成分是香豆素和蕓香甙)對患有淋巴血管靜脈炎的狗的血流量具有較好的穩(wěn)定作用。Kovach等[25]從黃花草木樨中分離到香豆素，給狗灌胃后發(fā)現(xiàn)，其能降低脈搏頻率，增加動脈心臟壓力、心率、心臟血容量以及大腦皮層、心肌層、腎臟外皮、肝和條紋肌的毛細(xì)血管循環(huán)。瑞士LINNEA公司開發(fā)了黃花草木樨提取物[26](香豆素含量不低于17％)，大量臨床試驗(yàn)表明該產(chǎn)品可用于治療慢性靜脈功能不全、下肢淋巴水腫，改善靜脈和淋巴循環(huán)、上皮細(xì)胞缺氧，增加冠脈血流量，降低心肌耗氧量，促進(jìn)胃腸運(yùn)動，加快傷口愈合，抑制熱水腫，減輕產(chǎn)科和婦科的毛細(xì)血管脆弱癥狀，治療痔瘡等。

4.3 改善血管平滑肌功能

Mislin[27]通過動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)香豆素對于豚鼠體外淋巴血管平滑肌有明顯的調(diào)節(jié)作用，能夠加快脈搏速度，增加血管容量和血循環(huán)，并激活血管收縮，從而具有調(diào)節(jié)血管收縮無力的作用。Zoltán等[28]研究表明，草木樨中分離得到的香豆素能夠減輕小鼠和豚鼠由異煙肼或者戊四唑引起的痙攣。

4.4 抗菌、抗病毒作用

高成富等[16]研究發(fā)現(xiàn)，草木樨香豆素提取物具有抗埃希氏大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏桿菌、變性球菌、白色葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌等常見致病菌的作用。杜曉峰等[29]測定了不同溶劑的黃花草木樨提取物對植物病原真菌的抑菌活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃花草木樨的乙酸乙酯提取物對玉米大斑病菌、油菜菌核病菌、白菜黑斑病菌、稻瘟病菌以及番茄灰霉病菌的抑菌活性高，對小麥條銹病和白粉病也有較好的防治效果。

4.5 抗凝血作用

草木樨香豆素通過抑制多種血管活性物質(zhì)釋放，抑制ADP和膠原誘導(dǎo)的血小板凝集，并抑制5-HT、血小板第Ⅳ因子、TXA、PDGF血小板的釋放，可有效地改善患者術(shù)后的高凝狀態(tài)。同時(shí)能增強(qiáng)血管強(qiáng)度和彈性，降低血管阻力，促進(jìn)血液流動和循環(huán)，從而有效地預(yù)防下肢靜脈血栓。錢愛民等[30]采用手術(shù)聯(lián)合草木樨流浸液片治療慢性下肢靜脈功能不全，臨床結(jié)果表明，患肢的疼痛、腫脹、潰瘍及色素沉著等癥狀明顯改善。張強(qiáng)等[31]用草木樨流浸液片治療下肢深靜脈血栓形成后遺癥(PTS)，療效顯著、安全、依從性好。

此外，草木樨香豆素還具有雌激素樣作用等藥理作用。

5 展望

草木樨中有效成分(香豆素、黃酮等)的開發(fā)是中藥現(xiàn)代化的任務(wù)之一。目前，草木樨香豆素類化合物的化學(xué)成分、含量測定、提取純化工藝研究較多，藥理研究集中于上個(gè)世紀(jì)，而質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)鮮有報(bào)道。隨著相關(guān)研究的進(jìn)一步深入，其有望開發(fā)成一類具有較高經(jīng)濟(jì)效益和社會效益的產(chǎn)品，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品及功能食品。

參考文獻(xiàn)：

[1]李靜.黃花草木樨香豆素類和黃酮類化學(xué)成分研究[D].武漢：湖北中醫(yī)學(xué)院，2007.

[2]陶君彥.草木樨抗炎活性物質(zhì)及抗炎作用機(jī)理研究[D].武漢：華中科技大學(xué)，2007.

[3]傅傳剛，楊巍，孫建華，等.草木樨流浸液片劑減輕肛門直腸術(shù)后水腫疼痛出血的臨床研究[J].中華胃腸外科雜志，2004，7(1)：45-48.

[4]張雷，鐘華.草木樨流浸液片治療皮膚擦傷60例療效觀察[J].嶺南急診醫(yī)學(xué)雜志，2006，11(3)：194-495.

[5]徐春敏，朱樂亭，韓容.草木樨流浸液片[J].中國新藥雜志，2007，16(4)：332-333.

[6]Maeias F A，Simonet A M，Galindo J G，et al.Bioactive polar triterpenoids fromMelilotusmessanensis[J].Phytochemistry，1998，49(3)：709-717.

[7]孫居民，王鴻新，劉伯衡.草木樨中香豆素的薄層層析掃描測定[J].石河子農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1989，(1)：73-78.

[8]烏云，韓雪松，張建華.草木樨種籽中香豆素、雙香豆素含量的分析[J].中國草地，1998,(1):36-38.

[9]劉福林，文奮武，張德壽，等.草木樨中香豆素測定方法的研究[J].甘肅畜牧獸醫(yī)，1987，(5)：3-7.

[10]李瑜，吳王鎖，賈忠建.黃花草木樨中香豆素含量的測定[J].中國獸醫(yī)科技，1983，(7)：32-35.

[11]朱宏.草木樨中天然香豆素的提取分離研究[D].西安：西北大學(xué)，2008.

[12]張興福，薛艷，張鐵軍，等.HPLC法測定草木樨中香豆素[J].中草藥，2005，36(11)：1722-1724.

[13]陳惠芳.歐洲藥典(第五版)：草木樨(Melilot)[J].國外醫(yī)藥·植物藥分冊，2006，21(4)：184-185.

[14]Martino E，Ramaiola I，Urbano M，et al.Microwave-assisted extraction of coumarin and related compounds fromMelilotusofficinalis(L.) Pallas as an alternative to Soxhlet and ultrasound-assisted extraction[J].J Chromatogr A，2006，1125(2)：147-151.

[15]鄭國華，陶君彥，王永忠，等.草木樨藥材香豆素的含量測定[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2008，28(18):1569-1573.

[16]高成富，張海峰.草木樨提取物中香豆素、總多酚、黃酮的測定[J].科協(xié)論壇，2008,(7)：58-59.

[17]高成富.一種黃花草木樨提取物的制備方法及其藥用價(jià)值[P].CN 101 371 870A，2009-02-25.

[18]陶君彥，馮其麟，張寶徽，等.草木樨藥材中香豆素類化合物提取分離純化研究[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2008，28(14)：1173-1177.

[19]湯春妮.草木樨香豆素的提取、分離純化工藝研究[D].西安：西北大學(xué)，2010.

[20]http://www.alphalink.21jp.com/test/products/weightloss/m-elilot2.html,2005-05-30/2010-03-18.

[22]F?ldi-B?rcs?k E，Bedall F K，Rahlfs V W，et al.The antiinflammatory and anti-edematous effects of coumarins fromMelilotusofficinalis[J].Arzneimittel Forschung，1971，21(12)：2025-2030.

[23]Zoltán O T，F(xiàn)?ldi M.Conditioned reflexes in experimental lymphogenic encephalopathy and their therapeutic modification by coumarin fromMelilotusofficinalis[J].Arzneim Forsch，1970，20(3):415-416.

[24]F?ldi M，Zoltán O T，Piukovieh I，et al.Behavior of the hematocrit value in experimental lymphangiothrombophlebitis[J].Arzneim Forsch，1970，20(11)：1633-1635.

[25]Kovach A G，Hamar J，Dora O，et al.Effect of coumarin fromMelilotusofficinalison the blood circulation in the dog[J].Arzneim Forsch,1970，20(11)：1630-1633.

[26]http://www. linnea-worldwide. com/. html,2002-08-09/2010-03-18.

[27]Mislin H.Effect of coumarin fromMelilotusofficinalison the function of the lymphangion[J].Arzneim Forsch,1971，21(6):852-853.

[28]Zoltán O T，F(xiàn)?ldi M.Effect of coumarin fromMelilotusofficinalison the convulsion threshold of the central nervous system of rats and guinea pigs[J].Arzneim Forsch,1970，20(11):1625-1629.

[29]杜曉峰，馮俊濤，馮崗.黃花草木樨提取物抑菌活性初探[J].西北植物學(xué)報(bào)，2008，28(6)：1233-1238.

[30]錢愛民，段鵬飛，桑宏飛，等.草木樨流浸液片聯(lián)合手術(shù)治療慢性下肢靜脈功能不全療效觀察[J].老年醫(yī)學(xué)與保健，2007，13(2)：117-118.

[31]張強(qiáng)，黃士明，孟路陽，等.草木樨流浸液片治療下肢深靜脈血栓形成后遺癥臨床療效研究[J].老年醫(yī)學(xué)與保健，2007，13(2)：115-117.