天麻色譜學分類與品質評價

譚碧君，孔海文，陶 鈞

(長沙理工大學化學與生物工程學院，湖南 長沙 410114)

生化指紋圖譜技術是鑒定和評價中藥和天然藥物質量最有效的科學方法之一。通過測定生化指紋圖譜能檢測到藥用植物中絕大多數生化成分，不僅能反映不同來源的同種藥物的共性，而且能顯示同種不同遺傳類群天然藥物的特殊性，并能根據指紋圖譜相似性對其進行系統分類，也能根據各種生化成分的峰面積確定其含量并作出科學評價，還能用于不同來源的同種藥物以及同一來源的不同種藥物的鑒定。HPLC指紋圖譜精確、高效，是測定生化指紋圖譜最常用的方法[1～3]。因此，中國食品藥品監督管理局已將HPLC指紋圖譜列為中藥和天然藥物的質控標準[SFDA，2007(743號)]。研究先進、實用的天然藥物生化指紋圖譜鑒定技術已成為研究熱點[4～7]。

天麻是我國四大名貴中藥材(冬蟲夏草、人參、鹿茸)之一。天麻及其有效成分天麻素具有多種藥理作用[8～12]，且毒副作用小。天麻的質量和真偽通常憑肉眼觀察和經驗，根據天麻個體大小、成色和原產地來判斷，缺乏科學性。為了建立天麻質量和真偽的評價方法，王莉等[13]、謝笑天等[14]、張煒等[15]研究了天麻的HPLC指紋圖譜識別和評價方法，但存在分離效果差、檢測到的生化成分少、圖譜不夠清晰、檢測時間長、浪費大量化學試劑等問題，尤其未見利用指紋圖譜相似性對藥用植物進行分類和評價，探討生化指紋圖譜、有效成分含量和原產地三者之間關系的報道。

為了建立天麻生化指紋圖譜最佳測定方法，利用指紋圖譜對天麻進行科學分類和評價，作者運用優化的高效液相色譜方法測定了9種天麻的生化指紋圖譜及其天麻素含量；運用分析軟件計算了它們的生化指紋圖譜的相似系數；運用聚類分析方法和相似系數對天麻進行系統分類；并根據天麻素含量和色譜峰面積對天麻品質進行綜合評價。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

9種天麻樣本分別采自湖南石門、湖北宜昌、安徽大別山、貴州大方、陜西略陽、西藏察愚、云南彝良、四川涼山和吉林長白山。每種天麻采集12個樣本(大、中、小各4個)，由湖南德海藥材開發公司專家鑒定后，儲存于-70 ℃冰箱中。

標準天麻(批號120944-200905)、天麻素對照品(批號110807-200905，純度99％以上)，中國藥品與生物制品檢定所。

乙腈為色譜純，其它試劑均為分析純。

Agilent 1100型高效液相色譜儀[DE43628782型液壓泵、JP40718258型樣本注射器、DE43623222型檢測器、Eclipse XDB-C8色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)],德國Waldbronn公司;JY92-2D型超聲波細胞破碎器,浙江。

1.2 天麻素對照品溶液的制備

精確稱取天麻素對照品(80 ℃干燥1 h)0.5 mg，置10 mL容量瓶中，用10％乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜過濾，置冰箱中備用。

1.3 天麻樣本處理

新鮮天麻蒸煮、烘干后，研成粉末，過80目篩，然后置80 ℃ 干燥箱中烘1 h。精確稱取1 g天麻粉末置萃取器中，加70％ 乙醇溶液混勻。先將萃取器置于97 ℃熱水中處理20 min；再用超聲波處理25 min(超聲波處理9 s，停2 s，功率250 W)。超聲波處理后用乙醇溶液補足損失的水分。同法重復處理1次。用濾紙過濾處理過的樣本溶液，收集濾液。蒸發，獲得干燥萃取物。用流動相溶解萃取物，用0.45 μm濾膜過濾，置冰箱中備用。

1.4 色譜條件的篩選

基本色譜條件為：柱溫25 ℃，流速1 mL·min-1，進樣量20 μL。

以10％乙腈溶液和梯度濃度乙腈溶液(0～1.5 min為純水,1.6～3.5 min為5％乙腈,3.6～8 min為10％乙腈)為流動相，以221 nm為檢測波長，用高效液相色譜儀測定天麻樣本的生化指紋圖譜，比較兩種不同流動相的分離效果，篩選最適流動相。

以優化的梯度濃度乙腈溶液為流動相，比較5種檢測波長(221 nm、219 nm、217 nm、215 nm、213 nm)檢測效果，篩選最佳檢測波長。

1.5 方法的精密度、天麻素的穩定性和回收率測定以及樣本量與天麻素含量的線性分析

方法的精密度、天麻素的穩定性和回收率參照文獻[14]進行。樣本量與天麻素含量的線性分析參照文獻[16]進行。

1.6 天麻生化指紋圖譜測定

采用優化的參數(梯度濃度乙腈溶液、219 nm波長)和選定的基本色譜條件測定天麻樣本的生化指紋圖譜。

1.7 數據統計與處理

樣本天麻素含量采用下式計算：

式中：YYH為單位質量樣本的有效成分含量；YYM 為樣本有效成分峰面積；YDZ 為有效成分對照品的質量；YDM 為有效成分對照品峰面積；YZ為樣本的質量。

運用中藥色譜指紋相似度評價系統(2004A，由中南大學設計)計算樣本色譜指紋圖譜的相似系數。運用SPSS11.5軟件(類平均聚類法)和相似系數構建相似樹狀圖。根據相似樹狀圖對天麻種群進行系統分類。采用非配對兩樣本平均數差異顯著性t檢驗[16]，分析天麻類群之間的天麻素含量差異顯著性。根據平均天麻素含量和分離峰總面積對天麻樣本和種群的品質進行鑒定與評價。通過比較，闡明天麻生化指紋圖譜、有效成分含量和來源地的關系，從而發現優良天麻品種和適宜種植地區。

2 結果與討論

2.1 最佳流動相的篩選

分別以10％乙腈溶液和梯度濃度乙腈溶液為流動相，以221 nm為檢測波長，測定天麻標準品的生化指紋圖譜，結果見圖1。

圖1 以10％乙腈溶液(A)、梯度濃度乙腈溶液(B)為流動相的天麻標準品的生化指紋圖譜

由圖1可知，梯度濃度乙腈溶液比10％乙腈溶液的分離效果好。前者分離出18種成分，而后者只得到9種成分，而且分離效果差。這是由于10％乙腈對天麻化學成分具有很強的洗脫作用，洗脫速度過快。因此，選擇梯度濃度乙腈溶液為流動相。

2.2 最佳檢測波長的篩選

以優選的梯度濃度乙腈溶液為流動相，以221 nm、219 nm、217 nm、215 nm、213 nm 5種波長測定天麻標準品的生化指紋圖譜。結果發現，219 nm下獲得的天麻素峰面積(3次平均值，mAU*s)最高，為9565.9，其余分別為9528.3、9372.7、9101.3、8832.6，相對其降低了0.4％、2％、4.9％、7.7％，表明用219 nm波長檢測天麻樣本能得到最大天麻素峰面積，檢測波長增大或減小都會使天麻素峰面積減少。5種波長下獲得的天麻各種生化成分總峰面積(mAU*s)分別為：48401.1、51671.6、54129.5、56964.1、59783.3。表明各種生化成分的總峰面積隨檢測波長的減小而增加。綜合考慮，選擇檢測波長為219 nm。

2.3 方法的精密度、天麻素穩定性和回收率檢驗

采用優化參數和選定的色譜條件重復測定天麻標準品的天麻素含量5次，相對標準偏差(RSD)為1.41％。 分別于0 h、12 h、24 h、48 h、96 h測定天麻標準品的天麻素含量，不同時間測定結果的RSD為1.36％。將1 mL天麻素對照品(1 mg·mL-1)分別加入到5個已知天麻素含量的天麻樣本中，再測定其回收率，平均回收率為97.7％、RSD為2.6％。

2.4 樣本量與天麻素含量的線性關系

采用優化參數和選定的色譜條件測定4 μL、8 μL、12 μL、16 μL和20 μL天麻標準品的天麻素含量。結果表明：樣本量x與天麻素含量y呈良好線性關系，擬合線性回歸方程為：y=0.40795x+0.3332,R=0.9998。

2.5 天麻的生化指紋圖譜測定

以梯度濃度乙腈溶液為流動相、以219 nm為檢測波長，在基本色譜條件下測定9種天麻樣本的生化指紋圖譜,選取有代表性的3類圖譜(其它圖譜未列出)，結果見圖2。

圖2 湖北天麻(A)、云南天麻(B)、四川天麻(C)萃取物的生化指紋圖譜

由生化指紋圖譜可見，來自同一地區或不同地區的同類型天麻(根據聚類分析判斷)具有十分相似的生化指紋圖譜；來自不同地區的不同類型天麻具有不同形狀的生化指紋圖譜和不同數量的分離峰(15～21個)。但所有天麻樣本都有8個共有特征峰，分別位于 1.29 min、2.70 min、4.88 min、5.44 min、5.83 min、6.37 min、6.60 min和7.09 min左右，平均RSD為1.36％，其中天麻素峰最穩定(位于5.44 min左右)，其RSD 為0.36％。

2.6 天麻生化指紋圖譜的相似性分析和種群分類

運用相似度評價系統計算天麻種群內樣本之間的生化指紋圖譜相似系數和種群之間的生化指紋圖譜相似系數，見表1和表2。

運用SPSS11.5軟件和表2中的相似系數構建天麻相似樹狀圖，見圖3。

表1 天麻種群內樣本之間生化指紋圖譜的相似系數

表2 9個天麻種群之間生化指紋圖譜的相似系數

圖3 9個天麻種群之間生化指紋圖譜的相似樹狀圖

根據相似樹狀圖可將9種天麻分成3個不同的類群：第Ⅰ類包括天麻標準品、湖南石門、湖北宜昌、安徽大別山、貴州大方、陜西略陽、西藏察愚和吉林長白山天麻，這一類天麻的生化指紋圖譜特征是：天麻素分離峰比其它所有成分的分離峰都高；第Ⅱ類包括云南彝良天麻，這一類天麻的指紋圖譜特征是：在2.4 min左右和7.0 min左右處有兩個高大的峰(分別占總峰面積的38.1％和25.2％)、而天麻素峰矮小(占總峰面積的5％左右)；第Ⅲ類包括四川涼山天麻，這一類天麻的指紋圖譜特征介于第Ⅰ類和第Ⅱ類之間，其2.4 min左右分離峰與Ⅱ類天麻的對應峰一樣高，7.0 min左右分離峰比Ⅱ類天麻的對應峰矮小，但其天麻素峰比Ⅱ類天麻的對應峰高得多，接近Ⅰ類天麻對應峰。

2.7 天麻種群的天麻素定量分析與評價

2.7.1 定量分析

根據樣本的天麻素峰面積，計算各種天麻樣本的平均天麻素含量，見表3。

表3 9種天麻的平均天麻素含量和分離峰總面積比較

由表3可知，湖北宜昌和湖南石門天麻的天麻素含量最高，分別達到7.52 mg·g-1、7.26 mg·g-1，其它成分含量也很高(根據其峰面積推算)；云南彝良天麻的天麻素含量最低，但其它成分含量很高。

統計和計算天麻各類群的平均天麻素含量和平均總峰面積，結果見表4。

表4 3類天麻的平均天麻素含量和平均總峰面積的比較

由表4可知，第Ⅰ類天麻的天麻素含量最高，平均含量為(5.67±1.50)mg·g-1；第Ⅱ類天麻的天麻素含量最低，平均含量為(1.70±0.36)mg·g-1，但各種成分總峰面積最大，為(67199±7051) mAU*s；第Ⅲ類天麻的天麻素和其它成分含量與它的生化指紋圖譜一樣，介于第Ⅰ和第Ⅱ類之間。這說明生化指紋圖譜與有效成分含量之間存在明顯的相關性。

采用非配對試驗兩樣本均數差異顯著性t檢驗，分析天麻各類群天麻素含量的差異顯著性。結果表明，第Ⅱ類天麻的天麻素含量與第Ⅰ類(t=3.621,df=22)和第Ⅲ類(t=2.630,df=5)相比具有顯著差異性(t>t0.05,P<0.05)，第Ⅰ類天麻的天麻素含量與第Ⅲ類相比沒有顯著差異(t=1.175，df=21，t0.05)。

2.7.2 天麻綜合質量評價

在第Ⅰ類天麻中，湖北宜昌和湖南石門天麻的平均天麻素含量最高，其它化學成分含量也很高，質量最好。這可能與湖南西北部和湖北西南部相鄰山區的適宜氣候和土壤有關，說明湖南石門至湖北宜昌之間的山區可能比較適宜種植天麻。盡管，吉林長白山天麻與湖北和湖南天麻具有相似的遺傳特性(根據它們具有相似的生化指紋圖譜推斷)，但各種成分含量成比例減少。這可能與東北長白山地區長時間氣候寒冷有關。這種相關性在其它天然藥物研究中也有報道[17,18]。

目前已知，天麻塊莖含有天麻素、天麻苷元、香草醛、香草醇、倍半萜類、嘌呤類等多種生化成分，其中天麻素是其主要有效成分；天麻素含量高低是判斷天麻質量的重要指標[13～15]。根據天麻素含量和其它成分峰面積進行綜合評價：第Ⅰ類天麻質量最好，因為其天麻素含量最高，其它成分含量也較高；第Ⅱ類天麻的天麻素含量最低，就天麻素含量而言，其質量較差，但其它成分含量最高，有其特色；第Ⅲ類天麻質量介于第Ⅰ類和第Ⅱ類之間。綜合比較分析發現，表現Ⅰ型生化指紋圖譜的天麻種群含有更多的天麻素，是優良的天麻類群。

比較同種天麻不同大小樣本的天麻素含量，發現天麻個體大小與天麻素含量沒有必然聯系。但是，一般說來，中等大小天麻含較多的天麻素和較多的其它成分。

2.8 方法評價

有幾種方法可用于同種藥用植物的分類。其中生化指紋圖譜分類具有明顯的優勢：既能確定藥用植物的遺傳本質，又能反映其基因表達的調控水平，還能直接觀察和確定其表型數量性狀的優劣，具有重要理論意義和應用價值。

實際應用效果表明，作者建立的生化指紋圖譜技術比以前報道的方法[15]要好，能有效地分離和檢測到天麻更多的生化成分和更高的天麻素含量(高2倍)，精密度高、重復性好、指紋圖譜清晰，可在更短的時間內(1/6左右時間)完成檢測過程。

本方法可用于天麻真偽鑒定。如果被測樣本具有天麻的8個共有特征峰便是真正的天麻，否則，便是偽天麻。

3 結論

本研究建立的HPLC指紋圖譜測定方法是測定天麻生化指紋圖譜的優化方法。根據生化指紋圖譜的相似性將9種天麻分成3類。表現Ⅰ型生化指紋圖譜的天麻含有更高的天麻素，是優良的種類，其中來自湖北宜昌和湖南石門的天麻質量最好，湖北宜昌至湖南石門之間的山區可能比較適宜種植天麻。天麻的生化指紋圖譜、有效成分含量和原產地三者之間存在明顯的相關性。本項目研究成果可應用于天麻系統分類、質量評價和品種鑒定與選擇。

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