百脈根ISSR－PCR反應體系的建立與優化

富新年，師尚禮，王 贊，李 俊，閆洪唯

（1.甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中－美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州730070；2.中國農業科學院 北京畜牧獸醫研究所，北京100193）

百脈根（Lotus corniculatus）又名牛角花，是豆科百脈根屬多年生草本植物，原產于歐亞溫暖地區，目前，在世界各地廣泛種植，具有優質、高產、抗逆性強、適口性好等特點，是一種優良牧草［1］。我國華南、西南、西北、華北等地均有分布，是溫暖濕潤地區極具潛力的牧草之一［2，3］。百脈根具有重要的經濟、生態和社會效益，研究和開發百脈根屬植物的種質資源具有十分重要的意義。目前，對百脈根種質資源遺傳多樣性的研究主要集中在形態學［4，5］、細胞學［6－8］以及基因工程方面的應用［9］，側重于百脈根屬植物ISSR（Intersimple Sequence Repeats）分子標記的研究報道較少。因此，本試驗旨在研究ISSR－PCR反應中各參數變化對實驗結果的影響，并對反應體系進行優化，建立適于百脈根的ISSR反應體系，為進一步研究百脈根種群遺傳多樣性奠定基礎。

ISSR標記是基于SSR標記技術開發出來，它避免了SSR標記開發難的缺點，是Zietkiewicz等［10］在1994年創立。基于真核生物基因組中含有大量的簡單重復序列，利用單一的通用引物擴增基因組DNA，進而檢測2個微衛星間DNA片段的多樣性。其基本原理是在微衛星序列的一端加錨1～4個隨意堿基，以此進行引物設計，PCR擴增引物兩端一段反向排列的SSR序列，通過瓊脂糖電泳和溴化乙錠染色，根據條帶的位置和有無，進行多態性分析。憑借其穩定性強、多態性高、節約時間、財力和物力等優點，現已是廣泛應用于牧草的分子標記技術之一［11，12］。

1 材料和方法

1.1 材料

選取15份來自俄羅斯的百脈根種質為實驗材料。供試的種質材料均由中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所提供，于2010年10月育苗，12月采樣。

1.2 基因組DNA的提取與檢測

采用改進的CTAB法［13］，從采集的百脈根葉片中提取DNA。用1%的瓊脂糖凝膠對DNA質量進行檢測，用1×TE緩沖液稀釋DNA原液至50ng/mL，－20℃保存以備后用。

1.3 ISSR擴增反應

實驗選取BUC811號為固定引物，其序列為GAGAGAGAGAGAGAGAC，由華大基因科技股份有限公司合成，Taq polymerase、dNTP、Mg2＋緩沖液均來源于TIANGEN公司。

PCR擴增程序為：94℃預變性4min；94℃變性45s，52℃復性60s，72℃延伸1min，共35個循環；72℃延伸7min，4℃保存。

1.4 正交表的設計

采用正交設計L16（45）在4個水平上進行實驗，對實驗結果進行直觀分析（表1，2）。根據每個組合產生條帶的豐富度、清晰度，對PCR擴增結果進行打分。最高計為10分，最低計為1分。根據分數的不同，求出每因素同一水平下的實驗值之和Ki以及平均值ki，并求得同一因素不同水平間平均值的極差R，從而得出百脈根ISSR－PCR反應各因素的最佳處理。

表1 ISSR－PCR反應的因素與水平Table 1 Factor－levels in ISSR－PCR reaction

表2 ISSR－PCR正交試驗設計方案Table 2 Orthogonal design in ISSR－PCR

1.5 退火溫度、循環次數篩選以及體系穩定性檢測

根據正交實驗結果，選擇最優的反應體系對退火溫度和循環次數進行梯度實驗，以Tm值為基準，上下浮動3℃，依次為47℃、50℃、53℃、56℃，循環次數設為30次、35次和40次。隨機選取2個引物用此體系對不同模板DNA進行PCR擴增，然后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，驗證所得最佳反應體系的可靠性和穩定性。

2 結果與分析

2.1 正交實驗結果及直觀分析

正交實驗PCR產物電泳16個組合的分數依次為8，8，4，1，3，9，6，6，7，7，3，7，8，7，9，8（圖 1）。極差 R反應影響因素對反應體系的影響，R值越大，影響越顯著。影響百脈根PCR反應的因素從大到小依次為：Mg2＋＞TaqDNA聚合酶＞dNTPs＞引物＞模板DNA；單個因素的最佳反應水平分別為：TapDNA聚合酶為第2水平，Mg2＋為第3水平，模板DNA為第2水平，dNTPs為第3水平，引物為第3水平。即理論最適反應水平組合為TaqDNA聚合酶1U＋0.15 mmol·L－1dNTP＋1.5mmol/L Mg2＋＋20ng模板DNA＋0.75μmol/L。但這一組合在正交表中并沒有出現，與分值最高的6號組合比較接近，僅dNTP和引物的用量不同。ISSR－PCR反應體系中，各個因素的變化都會造成擴增結果的不同，通過對優化方案的分析，從實驗效果以及經濟上來綜合考慮，最終確立的20μL百脈根ISSR－PCR的反應體系為：40ng模板DNA、2μL 10×PCR Buffer、0.15mmol·L－1dNTP、0.75μmol/L ISSR 引 物、1.5mmol/L MgCl2、1U TaqDNA聚合酶。

表3 正交設計直觀分析Table 3 The orthogonal design of intiutive analysis

2.2 退火溫度以及反應循環次數的篩選

退火溫度和循環次數對ISSR擴增條帶均有明顯的影響（圖2）。在30次循環時條帶較少（泳道1～4），從泳道5～8可以看出，在循環次數相同時，隨著退火溫度的升高，PCR產物的亮度增加，特異性增強，最佳退火溫度集中在50～55℃。從泳道2，6，9可以看出，在溫度相同時，循環次數太少，產物量低，條帶較弱，次數太多，導致引物二聚體增加，親戚非特異性擴增。由圖2可見，泳道7的條帶最清晰，特異性最強，故以53℃退火，35次循環為最佳反應條件。

2.3 優化反應體系的穩定性檢測

隨機選取ISSR引物BUC817和BUC825，采用最優體系對部分百脈根種質材料進行PCR擴增（圖3），能夠擴增出比較清晰的條帶，且穩定性較好，說明該反應體系適合于百脈根的ISSR－PCR反應。

圖1 ISSR反應體系正交設計擴增結果Fig.1 Amplified results of ISSR orthogonal designed reaction system

圖2 不同退火溫度和循環次數的擴增結果Fig.2 Effect of annealing temperatures and cycles on PCR amplification

圖3 不同引物在8份百脈根種質材料的ISSR擴增結果Fig.3 ISSR fingerprinting of some Lotus corniculatus germplasm

3 討論

PCR反應是ISSR檢測過程中最重要的環節，反應體系中各因素的變化均會對擴增結果造成影響。本研究采用正交設計L16（45）方法進行ISSR反應體系優化，獲得適合百脈根的ISSR－PCR最適反應條件。結果表明：Mg2＋濃度對反應體系的影響最大，這與王彥華等［14］研究的結果一致。Mg2＋是TaqDNA聚合酶產生聚合反應的必要條件，濃度過低，則對聚合酶的活化作用不夠，濃度過高又會抑制酶的活性；除此以外，Mg2＋濃度與模板DNA以及dNTPs的用量均有關系［15，16］，特別是dNTPs，因為dNTPs分子中的磷酸基團能定量地與Mg2＋結合［17］，從而產生拮抗作用，使實際反映中的Mg2＋濃度下降，從而影響聚合酶的活性。而Taq DNA聚合酶則受到酶活性、反應體積等多方面的影響，酶量過小，使得擴增產量降低，甚至沒有擴增，過大則出現非特異性擴增。對于dNTPs，作為PCR反應的重要底物，其用量的多少直接影響產物的產量，濃度過低就會影響PCR反應，濃度過高則會產生錯誤滲入，容易形成二聚體，從而影響擴增效率，并導致非特異性擴增的發生。在PCR反應體系中，引物和模板DNA的濃度過小，就會導致兩者結合的機率降低，導致擴增產物的穩定性降低；濃度過大則導致擴增過量，出現彌散現象，同時有可能帶入更多的雜質。因此，采取正交實驗篩選法，對百脈根ISSR－PCR反應各組成成分的適宜濃度進行了研究，最終確立20μL百脈根ISSR－PCR的反應體系為：40ng模板DNA、2μL 10×PCR Buffer、0.15mmol/L dNTP、0.75μmol/L ISSR引物、1.5mmol/L MgCl2、1UTaqDNA 聚合酶。

在ISSR擴增中，退火溫度和循環次數對擴增結果好壞具有明顯影響。退火溫度過低，容易出現背景重，彌散的條帶且擴增產物少；退火溫度過高，則引物與模板結合差，容易造成非特異性擴增，產物的豐富度降低。因此，只有在合適的溫度下才會產生清晰的、特異性的PCR條帶，在選擇最佳退火溫度時，如果擴增結果相近，宜選擇較高退火溫度以提高反應的特異性［18］。此外，不同的引物具有不同的退火溫度，要根據實際情況逐一篩選，從而獲得穩定可靠的標記結果。

相對于單因素設計和完全組合設計，正交設計減少了處理組合，而且考慮了各因素間的相互作用，節省了人力財力，能夠較快地獲得最優體系，但對結果的判斷存在一定的主觀性，因此，在后續的實驗中還需進一步優化，提高穩定性和可靠性。研究獲得ISSR反應體系可以為百脈根的后續工作提供參考，為運用ISSR分子標記技術進行百脈根種質資源的遺傳多樣性分析奠定一定的基礎，也為百脈根種質資源鑒定，親緣關系分析和優良品種選育等方面提供了有益參考。

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