煙草疫霉生防細菌的篩選及鑒定

舒曉玲，吳毅歆，周惠萍，毛自朝，李順德，何月秋,*

（1.云南農業大學農業生物多樣性應用技術國家工程中心，昆明 650201；2.云南農業大學農學與生物技術學院，昆明 650201；3.玉溪市農業局，云南 玉溪 663000）

煙草黑脛病是由煙草疫霉（Phytophthora parasitica var.nicotianae）引起的，是煙草生產中一類毀滅性真菌病害[1]。煙草黑脛病從苗床期到大田生長期均能發生，主要為害移栽后的大田煙株，造成植株莖基部呈水漬狀黑斑，后向上下及髓部擴展，直至植株萎蔫死亡。在防治上，主要采用種植抗病品種與化學藥劑等。然而，隨著綠色環保農業概念的推廣，應用對生態友好、防治效果穩定的生物制劑逐漸被人們所接受。植物根圍促生長細菌是生存在植物根圍中，對植物生長有促進或對病原菌有拮抗作用的有益細菌的統稱。近年來，許多研究表明，植物根圍促生長細菌在促進植物生長和防治植物病害方面有著其他微生物不具有的優勢。云南是煙草生產大省，黑脛病已成為煙草生產的重要限制因子。本研究于 2009—2010年在云南農業大學農業生物多樣性應用技術國家工程中心進行，旨在云南的煙田土壤條件下，篩選出適于環境，對煙草黑脛病具有防治潛力的芽孢桿菌，為防治該病提供生防菌株基礎。

1 材料與方法

1.1 土壤中細菌的分離

采用平皿稀釋法分離，從昆明市嵩明縣羊橋鄉和陸良縣馬街鄉煙田土壤中分離芽孢桿菌。將土壤稀釋成懸液，在70 ℃的水浴鍋中保溫10 min，以便殺死不耐高溫的真菌、細菌、放線菌及其他土壤生物。將處理過的土壤懸液涂布于固體平板培養基上，32 ℃的溫箱中培養24 h，挑取單個菌落，進一步劃線培養觀察菌落性狀并保存[2]。分離和抑菌作用采用 PDA培養基；性狀觀察用 NA、PDA、V8固體培養基；生長速度測定用LB液體培養基。

1.2 生防細菌的初步篩選

將分離得到的菌株劃線活化，挑取單菌落和煙草疫霉接種到同一個培養皿中進行對峙培養。兩者間隔2 cm，每個菌株設3個重復，3 d后觀察抑菌效果，以篩選具有明顯抑菌帶的生防菌株。

1.3 生防菌株B40-3抑菌作用的測定

將在 PSA平板生長好的煙草疫霉病菌用打孔器制成直徑6 mm的菌餅，接種于PSA平板中央，用接種環粘取菌株B40-3的單菌落在菌餅兩旁，距離菌餅2 cm左右劃兩道平行線。27 ℃培養3～4 d，測量抑菌帶的寬度[3]。

將保存的菌種在NA培養基上劃線活化。32 ℃培養24 h，待單菌落長出后，挑取單菌落放入LB液體培養基，在32 ℃，210 rpm條件下培養24 h，得到發酵液。制備煙草黑脛病病原菌的孢子懸浮液[4-5]，按陳方新等[6]的方法，將孢子懸浮液調至合適濃度，混入融化好并冷卻到40 ℃左右的PDA培養基中。將培養基倒入培養皿，制成帶菌平板。待培養基凝固后，在培養皿中間放入牛津杯。在牛津杯中加入生防菌發酵液200 μL。27 ℃培養3～4 d，測量抑菌圈的大小。

1.4 生防菌株B40-3的抑菌譜測定

選擇實驗室保存和田間為害較嚴重的 13種病原真菌測定B40-3的抑菌譜。病原真菌包括：煙草疫霉（Phytophthora parasitica var.nicotianae）、玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）、玉米彎孢霉病菌（Curvularia lunata）、康乃馨枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.dianthi）、蠶豆黑斑病菌（Alternaria sp.）、辣椒炭疽菌（Colletotrichum capsici）、棉花紅腐病菌（F.moniliforme）、小麥雪腐病菌（Typhula incarnate）、尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）、禾谷鐮刀菌（F.graminearum）、水杉赤枯病菌（Pestalotia foedans）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）和煙草赤星病菌（A.alternate）。

1.5 生防細菌B40-3最佳生長條件的測定

將OD600為1.2的細菌發酵液分別按照1%的接種量接種在LB液體培養基中。在25、28、30、32、34、37、40、42 ℃，200 rpm條件下振蕩培養24 h；37 ℃，120、150、170、190、210 rpm 條件下振蕩培養24 h；在37 ℃，210 rpm條件下振蕩培養 1、2、3、4、8、16、24、32、40、48、56、64 h時；測定OD600，以明確B40-3的最適生長溫度，搖床轉速的影響及生長曲線。各處理均重復3次。

1.6 生防細菌B40-3的初步鑒定

將B40-3接種在PSA、PDA、NA、LB等不同培養基上，觀察菌株在這幾種培養基上的生長情況。參照文獻[7]，將培養24 h的B40-3進行革蘭氏染色、芽孢染色，觀察細胞大小、形態、有無芽孢產生、芽孢產生位置等鑒定。

2 結 果

2.1 細菌的分離和初步篩選

從來自煙田的 70余份土樣中，得到表觀菌落形態不同的分離物200多個，篩選出對煙草黑脛病具有抑制作用的細菌1個，編號為B40-3。對峙培養3 d，抑菌帶寬度為0.9 cm（圖1）。牛津杯法進一步測定，抑菌圈直徑為2.3 cm（圖2）。

圖1 B40-3與煙草疫霉的對峙培養Fig.1 Dual culture of B40-3 and Phytophthora parasitica var.nicotianae

圖2 B40-3對疫霉孢子萌發的抑制Fig.2 Inhibiting spore germination of Phytophthora parasitica var.nicotianae by B40-3

2.2 生防細菌B40-3的抑菌譜

將B40-3菌株與病原真菌對峙培養于PSA平板上，結果表明，該菌株對 13個病原真菌菌株均有很好的抑制作用（表1），且對于不同的病菌抑制效果存在差異。抑制玉米彎孢霉病菌的作用最強，培養3 d后，抑菌帶達1.0 cm，抑制煙草赤星病的作用最弱，抑菌帶僅有0.3 cm。方差分析結果顯示，菌株B40-3對康乃馨枯萎病菌、玉米彎孢霉病菌、煙草疫霉病菌、玉米小斑病菌的抑制效果與對其他9種病菌相比，達到差異顯著水平。

表1 B40-3對13種病原真菌的抑菌作用Table1 Inhibition of B40-3 to 13 plant pathogenic fungi

2.3 生防菌株B40-3最佳生長條件

將B40-3菌株培養液調節至OD600為1.2，按照1%接種量接種至LB液體培養基中，所測定的結果如圖3～5。

2.3.1 最佳生長溫度 B40-3培養液的OD600與培養溫度成正比。在25～42 ℃，隨溫度的上升，生長速度加快。30 ℃以下，生長較為緩慢，30 ℃以上，生長速度較快。40 ℃和42 ℃時，測量的OD值高于37 ℃的OD值，表明該菌株能在37 ℃以上的溫度生長（圖3）。但在40 ℃和42 ℃時，培養液中已經有明顯的沉淀出現，可能是菌體密度太大導致相互粘附，不易準確測定，故在以后的試驗中將37 ℃作為培養溫度。

圖3 不同溫度對B40-3生長的影響Fig.3 Effect of temperatures on B40-3 growth

2.3.2 最佳搖床轉速 B40-3在37 ℃條件下，培養24 h時，于搖床轉速在120～210 rpm時，隨著搖床轉速的提高OD600值增大，達1.42（圖4），說明B40-3在生長過程中需要較多的通氣量。

圖4 不同轉速對B40-3生長的影響Fig.4 Effect of rotations on B40-3 growth

2.3.3 最佳培養時間 B40-3在37 ℃，搖床轉速為210 rpm條件下，培養2 h后進入指數生長階段，培養40 h后，菌量增長變得緩慢（圖5），且有大量芽孢形成，進入到停滯生長期。

2.4 初步鑒定結果

圖5 不同培養時間B40-3的生長曲線Fig.5 Growth curve of B40-3 with time

菌株B40-3在PSA培養基上形成的單菌落為圓形，乳白色至淡黃色，表面光滑，墊狀突起，菌落直徑3～4 mm，邊緣光滑。在PDA上形成的菌落和PSA無明顯差異。在NA培養基上，單菌落為圓形，淡黃至黃色，表面光滑，不突起，無褶皺，菌落直徑為1～2 mm，邊緣絲狀。在LB培養基上形成的單菌落為圓形，淡黃至黃色，表面光滑，不突起，無褶皺，菌落直徑為2～3 mm，邊緣絲狀。革蘭氏染色陽性，產芽孢，芽孢圓形、位于細胞中部或近端部。其生理生化反應與對照菌株枯草芽孢桿菌B.subtilis B168基本相似，依據形態特征及生理生化反應（表 2），初步將 B40-3鑒定為 Bacillus subtilis。

表2 B40-3的染色和部分生理生化實驗結果Table2 The result of physiological and biochemical tests

3 討 論

煙草黑脛病是煙草生產中的重要病害，目前在防治方法上主要有種植抗病品種、輪作、推廣高壟栽培與藥劑防治等，生物防治主要在實驗室和溫室中進行，尚缺乏與化學農藥相當且很穩定的生物防治制劑。在生物防治上，研究較多的有木霉屬真菌（Trichoderma）[8]、雙核絲核菌（Rhizoctonia）[9]、內生芽孢桿菌[10]、假單胞菌屬（Pseudomonas）[11-12]，腸桿菌屬（Enterobacter）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）和芽孢桿菌（Bacillus）[12-13]。

依據生態平衡原理分離有拮抗微生物菌株是一種常用策略，楊樹軍[14]從云南省9個地州29個縣的煙田中采集了141個土樣，以土壤稀釋平板法進行微生物分離和平板對峙培養法進行篩選，分離篩選出280個對黑脛病菌有拮抗作用的菌株，其中抑菌半徑大于17 mm的拮抗菌有19株。我們分離了200多個菌株，但僅分離到1株具有抑制黑脛病菌的枯草芽孢桿菌 B40-3，分離效率低于楊樹軍報道的研究結果。然而，本研究采用先在 70 ℃水中預處理土壤水溶液，殺死不能耐熱的菌株，僅留下產生芽孢的細菌；在楊樹軍的報道中未鑒定各個菌株的歸屬，也未說明它們是芽孢菌。王麗珍等[15]從重慶市煙草根圍土壤中采集 85份土樣，分離了26株對黑脛病菌有明顯抑制作用，其中24株為熒光假單胞桿菌（Pseudomonas fluorescens），2株芽孢菌（Bacillus）。芽孢桿菌已在植物病害生物防治中起重要作用，但對黑脛病菌有抑制作用并用于黑脛病防治的菌株報道很少。

本研究依據芽孢桿菌有很好的抗逆性和易于生產加工及商品化，分離出了枯草芽孢桿菌B40-3，并證明該菌株對 13種植物病原真菌也有很好的抑制作用。然而，該菌株對煙草黑脛病的防治效果還有待田間試驗的進一步證實。

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