利用3對SSR標記鑒定兩優287種子純度及對雜株類型的定量分析

郭承亮，耿月明

（湖北省種子集團有限公司，湖北 武漢 430070）

種子純度是種子質量的一個核心指標，是企業購銷種子的關鍵依據，也是企業生存之根本。種子純度檢測主要有海南大田種植鑒定（以下簡稱“南鑒”）、大田正季種植鑒定（以下簡稱“正鑒”）以及SSR分子標記鑒定等方法。三種方法各有特點：“南鑒”和“正鑒”是以田間種植方式，從植株的典型特異性判別、鑒定種子純度。“南鑒”具有鑒定相對準確、時間上相對提前的優點，但海南冬季屬短日低溫條件，感光類型及兩系不育系表現正常結實，兩系雜交水稻種子純度鑒定結果往往失真；“正鑒”具有鑒定準確、鑒定結果與大田生產吻合度高的優點，但時間明顯滯后，從歷年發生的重大種子質量事件來看，絕大多數是在得知種子純度不合格之前種子已經銷售到千家萬戶無法“召回”，最終釀成無法挽回的損失。SSR分子標記是檢測DNA水平上的生物個體差異，由于具有數量豐富、多態性高、遺傳共顯性、譜帶擴增穩定、精度高、檢測時間短、不受環境條件影響、實驗操作簡單等特點廣受重視；可以將呈父母本互補帶型的雜交種與其雙親、甚至一些異源花粉造成的雜交種區分開，因此成為品種鑒定的理想分子標記，在雜交水稻種子純度鑒定研究中得到了越來越廣泛的應用[1～4]。在目前的實驗操作中，由于受單個標記檢測的局限性，不能將一些雜株以及一些異源花粉造成的雜交種區分開。本研究首先利用24對SSR標記對兩優287及其大田正季鑒定中的9種雜株類型進行特異性分析，最終篩選出可將雜株類型相對區分開的3對SSR標記，并利用其對正季鑒定中的同一份樣本進行分析，鑒定出的種子純度及所含雜株類型比例與大田正季鑒定中的結果基本吻合。本研究通過多對標記對雜交水稻種子同一份樣本進行純度鑒定以及雜株類型定量分析，系統比較了兩種方法的鑒定結果，并分析了檢測結果的差異性原因，為公司兩優287種子的銷售提供了質量保證。

1 材料和方法

1.1 水稻材料

本研究包含2個試驗：試驗一中的雜株類型來自正季鑒定中收集的9種雜株類型，試驗二所用樣品為正季鑒定材料中的同一份樣本。

1.2 實驗方法

1.2.1 試驗一：在湖北省種子集團有限公司鄂州基地正季種植并按照當地栽培管理方法栽培兩優287樣品，調查雜交稻表型性狀，并統計雜株類型和田間調查鑒定結果。取正季鑒定中9種雜株類型與雜交種F1，取其葉片參照CTAB法[5]提取DNA，按照PCR擴增10μL體系：1 μL DNA 模板， 1 μL 10×PCR buffer，0.8 μL 25 mmol的 MgCl2，0.2 μL 的 10 mmol dNTP，0.1 μL 的10 μmol正 向 引物 （primer F），0.1 μL 的 反 向引物（primer R），0.2 μL rTaq 酶 （Takara，5 U/μL），6.6 μL滅菌ddH2O。PCR反應條件為：94℃預變性5 min，32～35個循環，每個循環94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，然后72℃延伸7 min。PCR電泳檢測：采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。

1.2.2 試驗二：取正季鑒定中同一份樣本的1920粒水稻種子，采用簡易法提取DNA[6～9]：剪取0.5 cm長的水稻幼苗（幼葉或幼莖），放入96PCR板的孔中，每孔加入 40μL 0.25 mol/L的 NaOH,在沸水中煮 30 s，然后加入 40μL 0.25 mol/L的 HCl和 20μL 0.5 mol/L的Tris（pH 8.0,含有體積分數為0.25%的IGEPALCA630）的混合液,在沸水中煮沸 2 min，用1μL進行PCR擴增，其余4℃保存。然后按照試驗一中的方法進行。

2 結果和分析

2.1 試驗一鑒定結果

通過田間調查鑒定了兩優287雜交稻材料的純度，選取其中的9種雜株類型，包括不育系9802 s、父本、紫稈紅稃尖、變異株1（比兩優287矮）、變異株2（比兩優287高）、紫稈遲熟株、遲熟株1（遲熟25天以上）、遲熟株2（遲熟15天左右）、青稞，歸類并統計雜株總數及所占比例，結果見表1。

2.2 試驗二純度鑒定及對雜株類型分析結果

利用24對SSR標記對兩優287大田正季鑒定中的這9種雜株類型進行差異化分析，最終篩選出3對SSR標記RM19、RM71、RM224可以將這9種雜株類型相對區分開：通過RM71可以鑒別4和5（變異株1和變異株2）以及7（紫稈遲熟株）；通過RM19可以鑒別1（不育系）；通過RM71與RM19同時可以將3和6歸在一起鑒別出來；通過RM71、RM19、RM224可以將2、8、9分別鑒定出來，結果見表 1。

表1 兩系雜交水稻種子純度大田正季鑒定和三對SSR標記鑒定結果

2.3 試驗一與試驗二純度鑒定及雜株類型分布結果比較

通過3對SSR標記和田間調查，鑒定了兩優287雜交稻材料的純度并對雜株類型進行定量分析 （見表1），結果表明，經過多對SSR標記檢測的純度為96.61%，而田間調查鑒定結果為97.10%，分子標記檢測和田間調查鑒定結果基本吻合，各種雜株類型的分布基本一致，但是通過分子標記檢測到0.31%的其它基因型的雜株。

3 討論與結論

本研究結合大田正季種植鑒定，利用多對SSR標記系統分析了兩優287純度、各雜株類型相互間的區別并對樣本進行分析統計。按照需求，選取了其中的3對SSR標記，可以將9種雜株類型全部鑒定出來并相對應歸類。研究還發現，利用多對SSR標記鑒定的結果與大田正季鑒定的結果基本一致，各種雜株類型所占的比例也基本一致。但是通過3對SSR標記鑒定分析，還發現與9種雜株類型的基因型不一致的其他一些基因型雜株，對這些基因型所代表的雜株表現型還有待在正季鑒定中進一步研究。

本次研究對同一份樣本采取兩種鑒定方法鑒定種子純度，產生一定的差異。研究認為，造成多對SSR標記鑒定純度偏低的主要原因是：有一些雜株在正季鑒定中不表現出雜株表現型，而SSR標記能較明顯的顯示出是雜株，3對SSR標記檢測中發現有0.31%的其它雜株類型的基因型。其次，兩優287的父本在大田正季鑒定中也較難以明顯鑒定出來，所以也導致大田正季鑒定的父本所占比例較SSR標記鑒定的結果低0.12%。

本研究是本公司利用自己建立的生物實驗室，結合企業所在制種基地的實際生產情況，將兩優287大田制種和SSR標記試驗純度鑒定結合起來進行分析比較，首次嘗試采用多對SSR標記精確鑒定兩優287的種子純度及所含雜株類型定量分析。我們下一步擬采用這種方法，對每一個品種所有的雜株類型進行SSR標記特性分析，初步建立每個品種的SSR標記指紋庫，然后結合大田制種的實際情況，選取幾對SSR標記進行種子純度及雜株類型定量分析，確保公司種子安全。

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