牛組織中氨丙啉殘留的HPLC檢測方法研究

陸春波，陳慧華，林仙軍，應(yīng)永飛，周 煒，羅成江

(浙江省獸藥監(jiān)察所，杭州 310020)

氨丙啉(amprolium)，化學(xué)名1－〔(4－氨基－2－丙基－5－嘧啶基)甲基〕－2－甲基吡啶氯化物，是一種抗原蟲藥，從1960年開始就被廣泛應(yīng)用于防治球蟲病，具有高效、安全，不易引起球蟲耐藥性等優(yōu)點。氨丙啉毒性雖低，但長期高濃度應(yīng)用能引起雛雞硫胺缺乏而表現(xiàn)多發(fā)性神經(jīng)炎，對產(chǎn)蛋雞禁用，水貂、牛、羊可用。隨著氨丙啉在養(yǎng)殖業(yè)中的廣泛應(yīng)用，其在動物性食品中的殘留問題也日益突出。美國FDA、日本、韓國、加拿大等國家均規(guī)定了氨丙啉在動物組織中的最高殘留限量，我國也作了相關(guān)規(guī)定。農(nóng)業(yè)部制定了牛組織中的最高殘留限量(MRL)［1］(牛肌肉500 μg/kg，牛脂肪2000 μg/kg，牛肝500 μg/kg，牛腎 500 μg/kg)。為保障動物源性產(chǎn)品食用安全性，保障消費者的身體健康，加強動物性食品中的氨丙啉殘留的監(jiān)測和檢驗工作，建立一種簡單快速、靈敏度高的氨丙啉殘留檢測方法已是刻不容緩。對飼料、畜產(chǎn)品和其他樣品中氨丙啉的檢測，國內(nèi)外已經(jīng)應(yīng)用的主要是高效液相色譜法(HPLC)［2－4］、液相色譜—質(zhì)譜法(LC/MS)［3－7］等方法。本研究建立了牛肌肉、肝、腎以及牛脂肪中氨丙啉殘留的高效液相色譜方法，為該藥物殘留監(jiān)控提供了一種靈敏、高效、簡便的檢測技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 鹽酸氨丙啉對照品，含量99.9%，批號 H0030811，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。Waters 2695高效液相色譜儀(配2487型紫外檢測器);XS－205電子天平(Mettler公司);SL502 N電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器公司):3k30型冷凍離心機(Sigma公司);20通道固相萃取裝置(Waters公司);MS2 minishaker渦旋混勻器(IKA公司);Waters HLB固相萃取小柱(500 mg，6 cc);乙腈、甲醇為色譜純;庚烷磺酸鈉為高效液相色譜專用試劑;冰醋酸、三乙胺為分析純。

1.2 溶液配制 標準貯備液:精密稱取適量的鹽酸氨丙啉對照品，用甲醇溶解并定容，配制成含氨丙啉100 μg/mL的貯備液，密封，－20℃保存。磷酸鹽緩沖液:取磷酸二氫鉀13.6 g，加水溶解后并稀釋至1 L，用氫氧化鈉溶液(5 mol/L)調(diào)節(jié)pH值至7.0。庚烷磺酸鈉溶液:取庚烷磺酸鈉1.2 g加水至1000 mL，再加冰醋酸24 mL，三乙胺6 mL，混勻。

1.3 色譜條件色譜柱為Waters XTerraR○MS C18色譜柱，4.6 mm ×250 mm，粒徑 5 μm;進樣量20 μL;流動相為庚烷磺酸鈉溶液 －甲醇 －乙腈(60 ∶35 ∶5，V/V);流速 1.0 mL/min;柱溫 30 ℃;檢測波長267 nm。

1.4 標準曲線的繪制 精密量取氨丙啉標準貯備液，用流動相稀釋成濃度為 0.20 ～20.0 μg/mL 的標準系列工作溶液，供高效液相色譜分析。以氨丙啉的峰面積為縱坐標，以氨丙啉濃度為橫坐標，繪制標準曲線，求標準曲線方程和相關(guān)系數(shù)。

1.5 樣品前處理

1.5.1 提取 稱取(5±0.05)g試料于50 mL離心管中，加入乙腈10 mL，以10000 r/min速度勻質(zhì)1 min，再以5000 r/min離心5 min，收集上清液。殘渣中再加入乙腈10 mL，同樣步驟操作后合并上清液，加入正丙醇5 mL，在50℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至干，用20.0 mL磷酸鹽緩沖液溶解殘渣，作為備用液。

1.5.2 凈化 HLB固相萃取柱依次用5 mL甲醇、5 mL水活化，準確量取1.5.1項中備用液5～10 mL過柱，用5 mL水淋洗，擠干。用4.0 mL流動相洗脫，擠干，收集洗脫液，混勻，過濾膜后供高效液相色譜分析。

1.6 方法準確度和精密度 采用標準添加法，在空白脂肪中添加定量限、1/2MRL、MRL、2MRL四個不同濃度的氨丙啉進行回收率試驗;在空白肝臟、空白肌肉、空白腎臟中添加1/2MRL、MRL、2MRL、4MRL四個不同濃度的氨丙啉進行回收率試驗，各濃度進行5個樣品平行試驗，重復(fù)3次以上，求批內(nèi)、批間相對標準偏差。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性關(guān)系 在濃度0.20～20.0 μg/mL的范圍內(nèi)，氨丙啉的峰面積與其濃度呈線性關(guān)系，且線性關(guān)系良好，線性回歸方程為y=39655x－2459.1，相關(guān)系數(shù)r2為0.9999，線性回歸圖見圖1。

圖1 氨丙啉標準曲線線性回歸圖

2.2 色譜條件的優(yōu)化 本實驗先后使用了Waters XTerraR○MSC18色譜柱(250 mm×4.6 mm，粒徑5 μm)和 Waters Symmtry C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，粒徑5 μm)，對不同流動相組成的分離效果進行了試驗，均出現(xiàn)主峰保留時間過短、易與雜質(zhì)峰混在一起的現(xiàn)象，或響應(yīng)值較低導(dǎo)致靈敏度降低。而當流動相組成中添加離子對試劑，如庚烷磺酸鈉溶液時，峰形較好，靈敏度較高，能與雜質(zhì)峰完全分離。適當提高庚烷磺酸鈉濃度和三乙胺的量可減小鹽酸氨丙啉峰的拖尾因子，改善峰形，但峰寬會變寬，靈敏度降低。經(jīng)反復(fù)試驗、調(diào)整，最后選定流動相為庚烷磺酸鈉溶液(庚烷磺酸鈉1.2 g加水至1000 mL，再加冰醋酸24 mL，三乙胺6 mL)－甲醇－乙腈(60∶35∶5，V/V)，此時目標物與雜質(zhì)能很好的分離，且峰形較好。

2.3 樣品的提取與凈化 本方法采用乙腈、磷酸鹽緩沖液分別對樣品進行提取。并在樣品量5 g(牛脂肪、牛腎臟)的前提下對提取條件進行了優(yōu)化。優(yōu)化時氨丙林在牛脂肪、牛腎臟的添加濃度均為1000 μg/kg，考慮到盡量減少有機溶劑用量和節(jié)約時間，本方法采用兩次提取，每次提取溶液用量10 mL進行實驗，結(jié)果表明，乙腈對樣品進行提取都得到了較好的回收率，用磷酸鹽緩沖液，由于提取后特別是牛腎臟組織，較為渾濁，無法過SPE柱進行凈化。

2.4 固相萃取條件的選擇 考慮到氨丙啉的理化性質(zhì)，采用C18、WCX柱和HLB柱固相萃取小柱，對牛脂肪1000 μg/kg添加做了回收率試驗，根據(jù)各自的最佳條件考察除雜質(zhì)效果和回收率，經(jīng)過反復(fù)試驗比較，選擇HLB柱作為牛組織中氨丙啉殘留測定的凈化柱，可以達到較好的凈化目的，且過柱回收率在80%以上。分別用甲醇5 mL，水5 mL充分活化HLB柱，準確移取5.0～10.0 mL備用液上柱，控制過柱速度在1 mL/min以內(nèi)。用水5 mL淋洗HLB固相萃取柱，擠干HLB柱，用流動相4.0 mL洗脫;另取4 mL流動相重復(fù)一次，同法檢測未發(fā)現(xiàn)氨丙啉，說明4.0 mL流動相可以將吸附在柱子上的氨丙啉完全洗脫下來。

2.5 檢測限和定量限 本方法稱取6份空白組織，按照1.5項下步驟處理后，測得基線噪音值，求其平均值，按信噪比S/N=3為檢測限，S/N=10為定量限，求得在牛的脂肪，肌肉、肝臟和腎臟中的檢測限為 100 μg/kg，定量限為 250 μg/kg，均低于國家規(guī)定的牛組織中的最高殘留限量要求，表明該方法可行，完全能滿足殘留分析要求。

2.6 準確度和精密度 在牛脂肪中添加濃度為200、1000、2000 和4000 μg/kg，在牛肌肉、肝和腎中添加濃度為250、500、1000 和2000 μg/kg 進行添加回收率試驗。牛肉、牛肝、牛腎在250～2000 μg/kg添加濃度范圍內(nèi)，回收率為60% ～110%;牛脂肪在200～4000 μg/kg添加濃度范圍內(nèi)，回收率為70% ～110%，批內(nèi)RSD＜15%，批間RSD＜15%。結(jié)果見表1，氨丙啉標準溶液色譜圖見圖2，各組織的添加色譜圖選取牛脂肪空白、添加氨丙啉的色譜圖(圖3、圖4)為代表。

表1 空白牛組織中氨丙啉添加回收率試驗結(jié)果

續(xù)表

圖4 空白牛脂肪添加試樣(1000 μg/kg)的色譜圖

3 結(jié)論

本研究建立了氨丙啉殘留方法，采用乙腈提取，用HLB固相萃取小柱凈化，提取效果好，回收率在60%以上。在牛的脂肪、肌肉、肝臟和腎臟中的檢測限為100 μg/kg，在牛的肌肉、肝臟、腎臟中定量限為 250 μg/kg，在牛的脂肪中定量限為200 μg/kg。批內(nèi) RSD ＜15%，批間 RSD＜15%。此方法可以為該藥物的監(jiān)控提供技術(shù)支持和保障，保證國際之間正常貿(mào)易往來、保障人類健康，具有十分重要的意義和實用價值。

［1］中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第235號公告［Z］.動物性食品中獸藥最高殘留限量，2002.

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