環介導等溫擴增法快速檢測結核分枝桿菌的臨床應用評估

陳濤 周琳 周杰 李海成 江勇 彭東東 周志剛 彭建明 文力何超文 錢明 孫毅凡 石磊 鐘球

環介導等溫擴增法快速檢測結核分枝桿菌的臨床應用評估

陳濤 周琳 周杰 李海成 江勇 彭東東 周志剛 彭建明 文力何超文 錢明 孫毅凡 石磊 鐘球

目的進行環介導等溫擴增法（LAMP法）快速檢測結核分枝桿菌的臨床驗證與應用，評估該方法在結核病臨床診斷中的效能>。方法選取廣東6地市專業結核病防治機構（簡稱“結防機構”）的肺部不同疾病及健康人員的痰標本2129份，分別采用直接涂片法、羅氏固體培養法及LAMP法檢測痰標本中結核分枝桿菌；另廣州、汕頭兩市337例結核病患者的痰標本濃縮處理后進行實時熒光定量（qPCR）及LAMP兩種方法檢測>。結果2129例痰標本中，直接涂片法、羅氏固體培養法和LAMP法的陽性檢出率分別為13.2%（282／2129）、21.7%（463／2129）和20.3%（432／2129）；同羅氏培養法相比，LAMP法靈敏度、特異度、陽性和陰性預測值分別為89.1%（432／485）、95.5%（1570／1644）、85.4%（432／506）和96.7%（1570／1623）；337例濃縮處理后的痰標本qPCR陽性率為35.0%（118／337），LAMP陽性率為35.9% （121／337）；LAMP法同直接涂片法檢測、羅氏固體培養法和qPCR法比較，檢測結果實際一致率分別為87.9%（Kappa值＝0.612）、96.1%（Kappa值＝0.89）和91.4%（Kappa值＝0.812）>。結論LAMP法用于痰標本中結核分枝桿菌檢測，其效能同羅氏培養法及qPCR法相當，同直接涂片法相比，LAMP法能夠大幅提高陽性檢出率，具有很好的臨床應用和推廣前景。

分枝桿菌，結核； 核酸擴增技術

結核病是全球衛生的主要挑戰之一。根據最新的《世界衛生組織全球結核控制報告》，2009年約有940萬結核病新發病例，170萬人因結核病而死亡。目前我國結核病年發病人數約為130萬，占全球發病的14.3%，位居全球第二位。

然而，與嚴峻的結核病形勢相比，結核病臨床診斷能力一直不如人意。目前的檢測方法主要有痰涂片直接鏡檢法、培養法、免疫學方法和以PCR技術為基礎的分子生物學法（如常規PCR、實時熒光PCR［1－3］、DNA 圖譜［4］等）。其中最主要的方法還是痰涂片直接鏡檢法和培養法，但其低檢出率及長檢測周期直接制約了其檢測效能；血清學方法特異度差；傳統PCR技術對于操作人員的技術要求及昂貴的儀器及耗材等直接制約了其推廣。因此，研究和開發新的快速、簡便、經濟及有效的診斷技術成為目前結核病實驗室研究的一大熱點。環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術是Notomi等［5］于2000年發明的一種全新的核酸擴增方法，該法具有PCR技術的全部優點，且使用高效的DNA聚合酶和2對引物，識別靶基因的6個不同區域，進一步縮短了檢測時間，增強了反應的特異度。該技術無需昂貴的核酸擴增儀和檢測設備，在等溫條件（60～65℃）下完成反應，擴增產物可以肉眼直接觀察，因此成本大大降低［5－9］，更利于基層單位推廣應用。

本研究對筆者成功建立并開發的結核分枝桿菌LAMP快速檢測反應體系進行優化和企業小批量的生產，并且將生產的試劑盒在廣東省6家臨床醫療單位的檢驗科進行現場驗證檢測，共檢測2129例不同肺部疾病患者及健康人的痰標本。LAMP檢測結果與直接涂片抗酸染色法、羅氏固體培養法比較；另外，選取其中部分樣本采用中山大學達安基因公司的MTB qPCR試劑盒檢測進行比較、驗證。

材料和方法

一、研究對象與標本

2129例（名）研究對象與標本來自廣東省結核病防治研究所及六家地級市結核病防治機構（簡稱結防機構）（東莞市慢性病防治院、佛山市慢性病防治院、惠州市慢性病防治院、江門市慢性病防治院、汕頭市慢性病防治院及廣州番禺區慢性病防治站）的不同肺部疾病患者及健康人（均提供知情同意書），收集采取上述對象的清晨深部咯出痰液。標本采用順序納入的方式納入2129例樣本（樣本量估算采用美國CDC提供的Epi InfoTM軟件，計算最低樣本量為1282例）。根據肺結核及其他肺部疾病的臨床診斷標準，即綜合病史、癥狀、體征、細菌學檢查、X線胸片等輔助檢查，以及診斷性治療效果等確診患者1327例為肺結核患者；581例為其他肺部疾病患者［包括上部呼吸道感染138例，慢性肺炎191例，哮喘、支氣管擴張及慢性阻塞性肺疾病193例，非結核分枝桿菌（NTM）感染引起的肺部疾病38例，不明原因的短期咳嗽、咯痰21例］；221名為健康人群。痰標本要足量（＞2ml），4℃保存，存放時間不超過2d。每一份痰標本分別采用直接抗酸染色法，羅氏固體培養法和LAMP法檢測。同時另選取337例肺結核患者痰標本先做濃縮處理后進行qPCR及LAMP法檢測。

二、標本處理

痰標本按照結核病細菌學檢驗規程進行前處理。直接堿處理法：向痰液中加入等體積的4%氫氧化鈉溶液，渦旋震蕩器震蕩，使標本液化均勻，在15～20min時間段內完成羅氏培養和LAMP檢測的操作；中和離心法（濃縮法）：向痰液中加入等體積前處理液（等體積4%氫氧化鈉和2.94%的檸檬酸三鈉混合，加N－乙酰半胱氨酸至其終濃度為1%），渦旋震蕩器震蕩，使標本勻化，室溫靜置15min，離心，沉淀用PBS溶解，再離心洗滌后加入50μl DNA提取液充分混勻，沸水浴10min，10 000g離心2min，收集上清用于qPCR和LAMP檢測。

三、痰涂片和培養

痰標本采用萋－尼抗酸染色法，按照《中國結核病防治規劃痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊》進行操作及鏡檢報告。

痰培養采用改良羅氏培養基堿處理后直接接種法。取前處理后的標本0.1ml，無菌操作接種于培養基斜面上，每份標本同時接種在兩管培養基上。放置于37℃培養箱中孵育。接種后3周觀察菌落生長情況，然后每周觀察結果一次。發現菌落生長者，可報告Mtb培養陽性，若滿8周仍無菌落生長，則報告培養陰性。

痰標本陽性與陰性定義：結核分枝桿菌陽性（true-positive）痰標本是指：（1）培養陽性且鑒定為Mtb；（2）培養陰性但涂片陽性，LAMP陽性且結合臨床表征診斷為結核病患者的標本。結核分枝桿菌陰性（true-negative）：（1）培養和涂片檢測均為陰性；（2）涂片陰性，培養陽性，但菌鑒結果為NTM菌群。

四、LAMP檢測

Mtb核酸檢測試劑盒（DNA恒溫擴增法）試劑盒由廣州迪澳生物科技有限公司提供（試劑盒引物見表1），按照試劑盒操作說明，將反應液60～65℃下反應60min，反應完成后立刻在80℃下進行反應終止。每輪反應均進行陽性及陰性對照反應。反應結束后，通過肉眼進行觀察，橙色表示結果為陰性，綠色表示結果為陽性（圖1）（注：本實驗的LAMP法檢測Mtb的特異度、敏感度、穩定性等方面的優化工作由本課題合作團隊早期完成，相關論文已發表［6］）。

表1 LAMP法檢測Mtb的引物

五、熒光定量PCR試劑盒

Mtb熒光定量PCR檢測試劑盒購自中山大學達安基因股份有限公司，按照試劑盒說明書進行操作。向PCR反應管［已含有耐熱DNA聚合酶、緩沖液（buffer）和脫氧核苷酸（dNTP）］中加入上述煮沸法提取的DNA模板2μl。PCR擴增程序為：93℃預變性2min，93℃30s，55℃45s，循環40次，72℃5min。

六、操作流程及質量控制

（1）LAMP-Mtb檢測反應體系的建立和條件優化工作由廣東省結核病防治研究所和華南理工大學輕工與食品學院共同完成。（2）臨床驗證實驗由6家臨床單位的臨床醫生和檢驗技師共同完成。所有參與醫師及檢驗技師經過專項的培訓，通過直接涂片抗酸染色、羅氏固體培養及LAMP檢測的熟練度測試合格后進入實驗。（3）所有試驗的涂片、培養及LAMP反應的產物及結果由廣東省結核病防治研究所按照數字表法隨機抽取復檢：涂片復染色后復檢、培養的陽性菌株的Mtb或NTM菌種鑒定及LAMP再次擴增。

七、統計學處理方法

本研究數據采用Office 2010收集整理，采用SPSS統計軟件的Wilcoxon秩和檢驗比較三種檢出率的差異性；采用配對卡方檢驗（McNemar Test）和Kappa檢驗（下同）分析三種檢測方法的一致性，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、抗酸染色涂片法、羅氏培養法和LAMP法檢出率比較

對2129例痰標本分別用涂片法、羅氏培養法和LAMP三種方法檢測 Mtb，結果見表2，涂片陽性294例［經硝基苯甲酸 （PNB）及噻吩-2-羧酸肼（TCH）試驗鑒別282例為 Mtb，12例為NTM］，陽性率為13.2%（282／2129）；羅氏培養陽性485例（經PNB／TCH 試驗鑒別463例為 Mtb，22例為NTM），陽性率為21.7%（463／2129）；LAMP擴增陽性506例（432例為Mtb，74例為假陽性），陽性率為20.3%（432／2129）。LAMP與抗酸染色涂片法的陽性檢測率不同，差異有統計學意義（Z＝6.565，P＝0.000＜0.05）；LAMP與羅氏培養法的陽性檢測率差異無統計學意義（Z＝1.273，P＝0.203＞0.05）（表2）。

圖1 LAMP反應結果圖

表2 直接涂片抗酸染色法、羅氏培養法及LAMP法檢測效果［例或名（占有率，%）］

表3 不同檢測單位直接涂片法、羅氏培養法及LAMP法檢測結核分枝桿菌的差異性分析

上述結果說明LAMP法比臨床最主要的檢測方法——涂片法的陽性檢出率高，且同結核病診斷參考標準——羅氏培養法相比，陽性檢出率效果相當。

二、三種檢測方法的檢出效能的差異性分析

432例LAMP陽性標本被確診為Mtb陽性（True-positive）；1530例 LAMP陰性標本被確診為Mtb陰性（true negative）；53例 LAMP陰性（22例涂片陽性，31例培養陽性且鑒定為Mtb）被確定為假陰性（false-negative）；74例LAMP陽性（其中，12例抗酸染色涂片和培養均陽性，10例培養陽性標本經［經硝基苯甲酸（PNB）及噻吩-2-羧酸肼（TCH）試驗鑒別鑒別為NTM；52例培養和涂片均為陰性被診斷為肺部其他感染性疾病）被確定為LAMP假陽性（false-positive）。LAMP法靈敏度、特異度、陽性和陰性預測值分別為87.0%～94.4%（總體為89.1%）、92.9%～97.0%（總體為95.5%）、83.1%～88.2%（總體為85.4%）和96.1%～97.9%（總體為96.7%），說明LAMP在臨床應用具有很高的診斷效能，與羅氏培養相比差異無統計學意義（表3）。

三、LAMP法同抗酸染色涂片法、羅氏培養法和qPCR檢測方法的一致性分析

1.將LAMP法與抗酸染色涂片法檢測Mtb的結果對比：兩種檢測方法結果的一致性為87.9%，預期結果的一致性為68.9%，Kappa值為0.612（P＝0.021＜0.05），Kappa值介于0.61～0.80之間，說明兩種檢測方法結果大部分一致（表4）。

2.LAMP法與培養法檢測結果比較：LAMP法和培養法的檢測結果的一致性為96.1%，預期結果的一致性為64.2%，Kappa值為0.89（P＝0.012＜0.05），說明這兩種檢測方法結果完全一致（表5）。

表4 LAMP法與直接涂片法檢測Mtb的一致性分析（例或名）

表5 LAMP法與羅氏培養法檢測Mtb的一致性分析（例或名）

3.LAMP法與qPCR法檢測結果比較：分別從廣州市和汕頭市選擇的337例結核病患者的痰標本，先進行中和離心（濃縮）后，再做LAMP法與qPCR法檢測。檢測結果為：LAMP法的陽性檢出率為35.9% （121／337），qPCR法的陽性率為35.0%（118／337）；兩種方法檢測結果的一致性為91.4%，預期結果的一致性為54.2%，Kappa值為0.812＞0.8（P＝0.033＜0.05），說明這兩種檢測方法的檢測效果完全一致（表6）。

表6 LAMP法與qPCR法檢測Mtb的一致性分析（例或名）

討 論

根據2010年全國第五次結核病流行病學調查結果［7］，估算我國全人群活動性肺結核患病率為392／10萬，其中傳染性肺結核患病率為100／10萬，也就是說我國平均每10萬人口中約有400名活動性肺結核患者，其中有1／4具有傳染性。據此估算2010年我國現有活動性肺結核患者總數為523萬，其中傳染性肺結核患者總數為134萬。由目前的趨勢預計，到2020年結核病仍將是全球重大傳染病之一。

研究和開發快速、簡便、敏感度好、特異度高的Mtb新的檢測方法成為亟待解決的問題。目前也涌現出一批具有一定市場應用前景的技術方案，例如反向雜交線性探針技術、Gene-Expert技術、基因芯片技術等，這些大部分仍處于實驗室開發和臨床前驗證階段。然而，在發展中國家，尤其是結核病發病率較高的中國、印度、巴基斯坦等國［7］，上述檢測方法的技術要求，儀器昂貴等問題將成為廣泛推廣的瓶頸。等溫擴增技術在日本、歐洲等國家得到廣泛研究和開發，但是到目前為止仍處于實驗室或者臨床前評估階段［8－17］，反應試劑的開發仍處于實驗室摸索階段，未能達到穩定性強、敏感度和特異度都能夠適合臨床應用的水平［18］。

本課題組研究的創新性在于成功實現了LAMP技術從實驗室研究向臨床應用的轉化，在技術的穩定性、方法的靈敏度及特異度方面均取得了令人滿意的結果。相比其他報道，本研究團隊經過近8年的研究，開發出一套完整、穩定的等溫擴增的反應體系和技術。筆者開發的針對Mtb的等溫擴增試劑盒及檢測技術在廣東省6家地市結核病防治專業醫院完成了的臨床應用及驗證評估，并取得了可喜的效果。本研究大大推進了LAMP技術在臨床應用，全面推廣指日可待。其優勢主要表現在以下幾個方面：（1）提高肺結核患者的陽性檢出率：同直接涂片抗酸染色相比，痰液中Mtb的陽性檢出率提高了64.3%（P＜0.05）；（2）檢測速度快：等溫擴增法的診斷效能幾乎等同于羅氏培養法，但是其檢出時間僅僅需要1h左右，大大降低了診斷延誤的時間和幾率；（3）操作方法簡單，無需特殊儀器：等溫擴增的操作沒有傳統PCR復雜和技術要求嚴格，同時不需要昂貴的擴增儀器；（4）實驗室交叉污染風險低：整個反應始終在密閉的環境（無需打開管蓋），最終通過肉眼辨別顏色變化來判斷結果，如果實驗人員不出現操作失誤（打開擴增產物的管蓋），該方法幾乎不存在擴增產物的氣溶膠污染實驗室的情況發生，在本研究臨床驗證的過程中，筆者多次對實驗室的環境和水樣做針對IS6110片段的PCR檢測實驗，未發現假陽性產生，說明實驗室沒有受到等溫擴增的產物污染；（5）本研究臨床驗證的實驗均由各自實驗室的技術人員獨立完成，雖然不同實驗室的實驗室環境、操作人員的技術水平和熟練度均存在一定差異，但最終的檢測報告顯示各自實驗室的檢測結果的差異性不具有統計學意義，說明筆者研究團隊開發的等溫擴增方法具有一定穩定性，具備了大面積使用的潛能，甚至可以在社區醫院或者鄉鎮衛生院開展。

隨著肺結核的反復發作及治療病程的延長，部分患者肺部感染為分枝桿菌復合菌群，甚至是Mtb和NTM復合感染。對于本試驗中出現22例LAMP檢測假陽性（鑒定為NTM菌）的患者，通過回復性觀察，發現有17例抗結核治療效果顯著；同時對22例NTM陽性產物進行分離培養，并再次LAMP試驗，僅發現7例LAMP陽性。因此，筆者高度懷疑其中多數患者同時伴有Mtb和NTM復合感染，為今后的相關研究提供了一種啟示。

本研究的試驗試劑只是針對人型Mtb進行檢測，因此無法檢測出Mtb復合菌群的其他類型及其他致病性的環境分枝桿菌，這在一定程度上影響了該方法的臨床檢出效能。隨著結核病發現力度的加大和控制水平的提高，一方面臨床上NTM感染引起的疑似結核病患者逐漸增多，迫切需要實驗室能夠檢測具體致病菌型；另一方面臨床醫生往往希望通過對菌株的活力及死活狀態的判斷來評估抗結核的效果。因此，開發出能夠同時檢測出多種分枝桿菌及能夠鑒別死活菌的等溫擴增試劑將成為下一步研究的重點。

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Clinical application of loop-mediated isothermal amplification method in rapid detection ofMycobacterium tuberculosis

CHEN Tao＊，ZHOU Lin，ZHOU Jie，LI Hai-cheng，JIANG Yong，PENG Dong-dong，ZHOU Zhi-gang，PENG Jian-ming，WEN Li，HE Chao-wen，QIAN Ming，SUN Yi-fan，SHI Lei，ZHONG Qiu.＊Center for Tuberculosis Control and Prevetion of Guangdong Province，Guangzhou 106130，China

ZHONG Qiu，Email：zhongqiu＠vip.163.com；ZHOU Lin，Email：gdtb＿bg＠vip.163.com

ObjectiveTo evaluate the diagnostic value of a loop-mediated isothermal amplification（LAMP）method for rapid detection ofMycobacterium tuberculosis.Methods2129sputum samples of suspected TB patients from 6cities in Guangdong province and 337enriched sputum samples randomly selected from Guangzhou and Shantou cities were collected.M.tuberculosisin 2129sputum samples were detected by smear，Roche solid culture and LAMP methods.M.tuberculosisin 337sputum samples were detected by quantitative polymerase chain reaction（qPCR）and LAMP methods. Results For 2129sputum samples，the positive rates of smear，culture and LAMP were 13.2%（282／2129），21.7%（463／2129）and 20.3%（432／2129），respectively.Compared with Roche culture method，sensitivity，specificity，positive predictive value and negative predictive value of the LAMP method were 89.1%（432／485），95.5%（1570／1644），85.4%（432／506）and 96.7%（1570／1623），respectively.For 337enriched sputum samples，the positive rates of qPCR and LAMP were 35.0% （118／337）and 35.9% （121／337），respectively.Compared LAMP with smear，culture and qPCR，the consistent rate of the results were 87.9%（K＝0.612），96.1%（K＝0.89）and 91.4%（K＝0.812），respectively. Conclusion The LAMP method was equivalent to culture and qPCR，superior to smear method in detectingM.tuberculosisof sputum specimens.In addition，LAMP method showed the advantages of rapid，simple operation and no equipment，indicating good prospects for clinical application and promotion in the diagnosis of tuberculosis.

Mycobacterium tuberculosis； Nucleic acid amplification techiques

“十二五”國家科技重大專項（2012ZX10004903）；“十二五”廣東省“結核病防治轉化”醫學重點實驗室

106130廣州，廣東省結核病控制中心參比實驗室（陳濤、周琳、李海成、江勇、錢明、鐘球）；廣東省佛山市第四人民醫院（周杰）；廣東省汕頭市結核病防治所（彭東東）；廣東省東莞市慢性病防治院（周志剛）；廣東省惠州市結核病防治所（彭建明）；廣東省江門市結核病防治所（文力）；廣州市番禺區慢性病防治站（何超文）；暨南大學醫學院微生物與免疫學教研室（孫毅凡）；華南理工大學輕工與食品學院（石磊）

鐘球，Email：zhongqiu＠vip.163.com；周琳，Email：gdtb＿bg＠vip.163.com

2012-05-16）

（本文編輯：薛愛華）