ARHⅠ和DAPK在人腦膠質瘤組織中的表達及意義

何瑞，袁志誠，湛利平，李巧玉

(1.江蘇大學附屬人民醫院神經外科，江蘇 鎮江 212002;2.江蘇大學臨床醫學院，江蘇 鎮江 212001)

膠質瘤是中樞神經系統最常見的惡性腫瘤，由于具有很強的侵襲性，且與周圍腦組織沒有明顯的界限，目前多采用以手術為主，結合放、化療的綜合療法，但治療效果仍不容樂觀，人們一直在探索各種新的治療方法來抑制腫瘤細胞的侵襲與轉移，從而提高治療效果［1］。本研究采用免疫組化方法檢測正常腦組織與不同臨床病理分級的腦膠質瘤組織中ras同源家族成員Ⅰ(aplysia ras homologⅠ，ARHⅠ)基因和死亡相關蛋白激酶(death associated protein kinase，DAPK)基因的表達，分析兩者的相關性，為臨床上對膠質瘤惡性程度、臨床預后及復發等方面的判斷和分析提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 標本來源

47例腦膠質瘤標本均取自本院神經外科2009年6月至2011年12月手術切除標本的冰凍蠟塊，其中男29例，女18例，年齡14～73歲，中位年齡38.5歲。10例正常腦組織均取自腦外傷減壓術患者。所有患者術前均未接受化療、放療或激素治療，所有病例均有組織病理學和(或)細胞診斷學依據。標本經10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色，嚴格按照WHO(2000年)膠質瘤分類標準進行病理分類、分級:Ⅰ級6例，Ⅱ級10例，Ⅲ級14例，Ⅳ級17例，全部病理切片均經兩名以上有經驗的病理科醫師同時確診。

1.2 主要試劑及儀器

ARHⅠ兔抗人單抗原液和SP免疫組化試劑盒均購自北京博奧森生物技術有限公司;兔抗人DAPK多抗原液購自武漢博士德公司。主要實驗儀器包括光學顯微鏡及光學顯微鏡照相系統(Olympus公司)，石蠟自動包埋脫水機(金華惠友儀器設備有限公司)，微波儀、顯微鏡、連續切片機(Leica公司)。

1.3 免疫組化染色

每例標本取2張切片，采用SP法進行染色。嚴格按照試劑盒說明書操作。結果判定:隨機選取5個高倍視野，每個視野計數100個細胞，ARHⅠ和DAPK的陽性染色均以細胞質和(或)細胞膜出現棕黃色顆粒為陽性表達，所有細胞按陽性細胞數及染色強度分為4級。陰性(－)，隨機視野中無陽性細胞;弱陽性(+)，陽性細胞數少于30%，著淺棕黃色;中度陽性(++)，陽性細胞數30% ～80%，著棕黃色;強陽性(+++)，陽性細胞數＞80%，著棕黑色。

1.4 統計學方法

應用SPSS 16.0統計軟件進行分析，ARHⅠ和DAPK蛋白在各級別膠質瘤中的陽性表達率比較均采用χ2檢驗，兩者間的相關性分析采用Spearman秩相關分析。以 P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人腦膠質瘤中ARHⅠ蛋白的表達

免疫組化結果顯示，ARHⅠ蛋白在正常腦組織中呈強陽性表達，而在不同級別膠質瘤組織中隨著腫瘤分化級別的降低和惡性程度的增高ARHⅠ的表達相應降低。ARHⅠ蛋白的陽性表達主要表現為細胞膜和細胞質呈不同程度的著色。見圖1。經χ2檢驗分析提示，隨著腦膠質瘤惡性程度的增高，ARHⅠ蛋白的陽性表達率相應降低，見表1。ARHⅠ在Ⅰ－Ⅱ級、Ⅲ級和Ⅳ級腦膠質瘤之間的表達，差異有統計學意義(P ＜0.05)。

圖1 ARHⅠ蛋白和DAPK蛋白在Ⅱ級、Ⅲ級膠質瘤組織中的表達(SP×200)Fig 1 Expression of ARHⅠ and DAPK in glioma of grade II and grade III(SP×200)

表1 正常腦組織和各級別腦膠質瘤中ARHⅠ的表達Tab 1 Expression of ARHⅠin normal brain and glioma of all pathological grades

2.2 人腦膠質瘤中DAPK蛋白的表達

免疫組化結果顯示，DAPK蛋白在正常腦組織中呈強陽性表達，而在不同級別膠質瘤組織中隨著腫瘤分化級別的降低和惡性程度的增高DAPK的表達相應降低。DAPK蛋白的陽性表達主要表現為細胞膜和細胞質呈不同程度的著色，見圖1。經χ2檢驗分析提示，隨著腦膠質瘤惡性程度的增高，DAPK蛋白的陽性表達率相應降低，見表2。DAPK在Ⅰ～Ⅱ級、Ⅲ級和Ⅳ級腦膠質瘤之間的表達，差異有統計學意義(P ＜0.05)。

表2 正常腦組織和各級別腦膠質瘤中DAPK的表達Tab 2 Expression of DAPK in normal brain and glioma of all pathological grades

2.3 ARHⅠ和DAPK在人腦膠質瘤組織中表達的相關性

經Spearman秩相關分析證實，在47例腦膠質瘤組織中，ARHⅠ有DAPK蛋白的陽性表達率之間呈顯著正相關(r=0.723，P ＜0.05)，即ARHⅠ表達越高，DAPK的表達也隨之增加。見表3。

表3 ARHⅠ和DAPK在膠質瘤組織表達的相關性例Tab 3 Relationship between the expressions of ARHⅠ and DAPK proteins in glioma tissues

3 討論

近年來的研究表明，在多種人類腫瘤中均存在自噬活性的改變，自噬作用是腫瘤細胞的一種適應性反應，對腫瘤細胞起保護作用，自噬活性的降低在乳腺癌和胃癌的發生、發展中發揮作用［2－3］。研究已證實腫瘤的發生發展是一個多基因的復雜演變過程。其中有兩類基因與腫瘤的發生、發展密切相關，一類是癌基因，另一類是抑癌基因。ARHⅠ是1999年由美國德克薩斯大學采用差異展示PCR(differential display PCR)發現的第一個ras家族中被報道的抑癌基因，又名NOEY2或ras同源基因家族成員I。Xu等［4］將人的ARHⅠ基因導入 FVB/B鼠體內，證實ARHⅠ在腎臟、肌肉、肺、腦、心臟均有表達。研究證實卵巢癌中存在 ARHⅠ的低表達［5］。Bao等［6］發現感染含ARHⅠ基因的腺病毒載體的腫瘤細胞株，5天后30% ～45%的乳腺癌和5% ～11%的卵巢癌細胞發生了凋亡。另外，有報道前列腺癌中存在廣泛的1p31缺失，而ARHⅠ基因正位于該區域［7］。上述研究結果表明，ARHⅠ是抑癌基因，它的缺失可能引起腫瘤的發生。本研究結果顯示，ARHⅠ在正常腦組織中均有表達，在腦膠質瘤組織中的陽性表達率逐漸下降，與乳腺癌、卵巢癌組織中的表達情況類似。隨著腦膠質瘤惡性程度的上升，ARHⅠ的表達逐漸降低甚至出現陰性表達，提示ARHⅠ的表達缺失可能促進腦膠質瘤的發生、發展。

DAPK基因的蛋白產物是一個相對分子質量為160×103的Ca2+/CaM調節的蘇/絲氨酸激酶，能通過 TNF-α，Fas、IFN-γ 等路徑誘導細胞的凋亡，并在腫瘤抑制中發揮關鍵性的作用。研究表明，DAPK在宮頸癌和原發性中樞神經系統淋巴瘤組織中出現表達的缺失［8－9］。胡禮炳等［10］發現正常膀胱黏膜上皮的DAPK基因的免疫組化染色呈強陽性，在膀胱癌組織中大多為陰性，少數為弱陽性染色。楊海艷等［11］發現DAPK在高分化子宮內膜癌組織中的表達明顯高于低分化子宮內膜癌。本研究結果表明，DAPK蛋白在正常腦組織中均有表達，在腦膠質瘤組織中的陽性表達率逐漸下降甚至出現缺失，與宮頸癌、子宮內膜癌、肺癌及膀胱癌組織中的表達情況類似。這說明在腦膠質瘤的發生、發展中DAPK也發揮了一定的作用。同時本研究表明，隨著腦膠質瘤惡性程度的上升，DAPK的表達逐漸降低甚至出現陰性表達，提示DAPK的表達缺失，可能也促進了腦膠質瘤的發生、發展。

DAPK在自噬中發揮核心作用，當微管相關蛋白1B(microtubule associated protein 1B，MAP1B)與DAPK結合為DAPK-MAP1B時，可介導膜泡和自噬小體的形成，激發自噬［12－13］，ARHⅠ通過上調自噬相關基因4，促進綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)-LC3-I裂解為自噬小體膜上的GFPLC3-II，直接參與LC3-II在自噬膜的定位與自噬小體的形成［14］。此外，兩者在自噬活性的調節中也相互協同［15］。DAPK可能發揮了自噬活動的門控作用，既為ARHⅠ作用的發揮創造了條件又控制了自噬的啟動。因此，ARHⅠ與DAPK共同參與自噬活性的調節與自噬小體的形成。本研究結果顯示，ARHⅠ和DAPK的表達水平均與膠質瘤的分化程度有關，隨著膠質瘤惡性程度的增高，兩者表達水平均呈降低的趨勢，并且兩者呈正相關。提示ARHⅠ和DAPK在腦膠質瘤的發生、發展中可能起協同作用。其表達強弱可反映膠質瘤的惡性程度。因此，同時檢測兩者的表達，有助于進一步了解膠質瘤的生物學特點，為臨床工作中對膠質瘤的形成模式、惡性程度、臨床預后及復發等方面的判斷和分析提供一種新思路，并有望作為判斷膠質瘤預后情況的生物學標志物。

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