響應面法優化油橄欖葉中橄欖苦苷超聲輔助提取工藝

閆樹軍，王 遠，蘇艷紅，饒在生，李 暉

(四川大學化學工程學院，四川 成都 610065)

響應面法優化油橄欖葉中橄欖苦苷超聲輔助提取工藝

閆樹軍，王 遠，蘇艷紅，饒在生，李 暉*

(四川大學化學工程學院，四川 成都 610065)

目的：研究油橄欖葉中橄欖苦苷超聲輔助提取最佳工藝條件。方法：選定甲醇體積分數、料液比和提取時間作為影響因素，以橄欖苦苷提取率為評價指標。在單因素試驗的基礎上，通過3因素3水平Box-Behnken試驗，建立橄欖苦苷提取率的二次多項式回歸方程，經響應面回歸分析得到優化組合條件。結果：最佳工藝條件為甲醇體積分數93.5%、料液比1∶25(g/mL)、提取時間26min。結論：油橄欖葉中橄欖苦苷提取率可達7.83%。

油橄欖葉；橄欖苦苷；超聲提取；響應面分析

油橄欖(Olea europare Linn)又名洋橄欖、齊墩果、阿列布等，為木犀科、木犀欖屬常綠喬木，主要分布在地中海沿岸國家和美國加州地區，現在世界各國均有栽培[1-2]。研究發現油橄欖葉中含有大量的生物活性物質，主要成分有裂環環烯醚萜及其苷(橄欖苦苷為主要成分)、黃酮及其苷、雙黃酮及其苷、低分子單寧等。現代藥理研究表明，橄欖苦苷具有抗真菌、抗炎、抗病毒、抗氧化，以及抗癌和降血糖等多種作用[3-4]。

目前油橄欖葉中橄欖苦苷的傳統提取方法主要采用水提和醇提法，提取物為含量3%～5%的粗制品，該法得率較低、操作費時、能耗大[5-12]。近年來，超聲波輔助提取方法廣泛應用于天然產物的提取中，其主要是利用超聲波的空化效應增大介質分子的運動速度，使可溶性活性成分迅速溶出，從而提高提取率，縮短提取時間，并且避免高溫對提出成分的影響[13-14]。本實驗利用超聲輔助提取油橄欖葉中橄欖苦苷，采用響應面分析(response surface methodology，RSM)多元二次回歸方程來擬合影響因素與響應值之間的函數關系[15]，通過對回歸方程進行分析優化工藝參數，為橄欖苦苷提取工藝的進一步開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

油橄欖葉購于甘肅；橄欖苦苷對照品(純度≥98%)成都曼思特生物科技有限公司；甲醇(分析純)、乙腈(色譜純) 美國天地公司；高效液相色譜用水為三次蒸餾水。

BS-224S電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司；KH-5200DE型數控超聲波清洗器 昆山禾創超聲儀器有限公司；1200高效液相色譜儀(配有四元泵及DAD檢測器) 美國安捷倫科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 橄欖苦苷的提取

將在60℃干燥至質量恒定的油橄欖葉粉碎后過篩(30～40目)，備用。準確稱取一定量的油橄欖葉粉，加入適量甲醇溶液，稱量，在100W超聲功率下提取一定時間后，冷卻至室溫，稱量，用甲醇溶液補充缺失質量，搖勻，過濾，棄去初濾液，取3 mL續濾液，過0.45μm濾膜，待測，計算油橄欖葉中橄欖苦苷提取率。

式中：C為橄欖苦苷質量濃度/(g/mL)；V為加入甲醇溶液體積/mL；m為油橄欖葉質量/g。

固定試驗條件提取時間3 0 mi n、甲醇體積分數90%、提取功率100W、料液比1∶25(g/mL)進行單因素試驗，研究各因素對橄欖苦苷提取率的影響。

綜合單因素試驗結果，采用Box-Behnken試驗設計原理，優化超聲提取油橄欖葉中橄欖苦苷的工藝條件。

1.2.2 標準曲線的繪制

準確稱取橄欖苦苷對照品7.88mg，加甲醇定容至5mL，搖勻，配成質量濃度1.576mg/mL的對照品溶液。分別移取395、315、235、155、80μL用甲醇定容至5mL，以峰面積對質量濃度繪制標準曲線，回歸方程：y＝5.593×10-8x(R2＝0.9986)，其中y為橄欖苦苷質量濃度/(mg/mL)；x為橄欖苦苷峰面積/(mAU·s)。結果表明橄欖苦苷在0.025～0.125mg/mL范圍內線性關系良好。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent extend C18(150mm×4.6mm，5μm)；柱溫30℃；流動相：乙腈-水(21∶79，V/V)[16]；檢測波長230nm；紫外檢測器；流速1mL/min。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 甲醇體積分數對提取率的影響

由圖1可知，橄欖苦苷提取率在90%甲醇溶劑處出現最大值。油橄欖葉中有很多極性不同的化合物，它們最適合的溶劑極性各不相同。因此，橄欖苦苷的提取率會隨著甲醇體積分數的增加先增大后減小。

圖1 甲醇體積分數對油橄欖葉中橄欖苦苷提取率的影響Fig.1 Effect of methanol concentration on the yield of oleuropein from Olea europaea leaves

圖2 料液比對油橄欖葉中橄欖苦苷提取率的影響Fig.2 Effect of solid-to-solvent ratio on the yield of oleuropein from Olea europaea leaves

2.1.2 料液比對橄欖苦苷提取率的影響由圖2可知，隨著提取液使用量的增大，橄欖苦苷的提取率逐漸上升，當提取液使用量超過1∶25時，橄欖苦苷提取率增加甚少。因此選取料液比1∶25。

2.1.3 提取時間對橄欖苦苷提取率的影響

圖3 提取時間對油橄欖葉中橄欖苦苷提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of oleuropein from Olea europaea leaves

由圖3可知，橄欖苦苷提取率在30min出現最大值，隨著提取時間的增加，提取率呈先上升再下降，其原因可能是由于橄欖苦苷超聲提取時間過長，超聲波引起產物結構變化降低提取率。因此選擇超聲提取時間30min。

2.1.4 提取次數對橄欖苦苷提取率的影響

圖4 提取次數對油橄欖葉中橄欖苦苷提取率的影響Fig.4 Effect of repeated extraction number on the yield of oleuropein from Olea europaea leaves

由圖4可知，1次提取率為6.70%，2次提取率僅為0.94%，考慮到時間、成本和能耗損失，故選擇提取次數為1次。

2.2 響應面分析與橄欖苦苷提取工藝的優化

選取甲醇體積分數、料液比、提取時間作為對橄欖苦苷提取率影響顯著的3個因素，在單因素試驗的基礎上采用3因素3水平的響應面分析方法進行試驗設計，試驗因素與水平見表1。

表1 橄欖苦苷提取響應面分析因素與水平Table 1 Variables and their coded levels tested in response surface analysis

表2 橄欖苦苷提取響應面分析方案及結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

響應面試驗設計及結果見表2。其中，試驗號1～12是析因試驗，而13～15是中心試驗，用來估計試驗誤差。采用Minitab 15軟件，使用未編碼單位對試驗數據進行多元回歸擬合結果見表3，其甲醇體積分數、料液比、提取時間的二次多項回歸模型為Y＝7.713＋0.091X1－0.024X2＋0.125X3－0.39X12－0.2X22－0.628X32－0.382X1X2＋0.005X1X3－0.19X2X3。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis of variance for the fitted regression equation

由表3可看出，根據P值判斷(P＜0.01時水平極顯著)，方程二次項和交互項影響明顯，其中二次項更為顯著，一次項影響相對顯著。說明響應值(提取率)的變化相對復雜，各具體試驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系。該模型的相關系數R2＝2.87724/2.92493＝98.37%，說明此模型與試驗實際擬合較好，試驗失擬較小，因此可用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結果進行分析。回歸系數顯著性檢驗表明，在所各取的因素水平范圍內，對油橄欖葉中橄欖苦苷的提取率影響排序為提取時間＞甲醇體積分數＞料液比。

響應面Y對于因素X1、X2、X3值構成的三維空間在二維平面上的等高線圖，可直觀地反映各因素之間的相互作用。Minitab 15軟件處理得到響應面分析結果見圖5。

圖5 各兩因素交互作用對橄欖苦苷提取率影響的響應面與等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots for the effects of pairwise interactions of three variables on the yield of oleuropein from Olea europaea leaves

模型的響應曲面及其等高線直觀地反映了各因素對響應值的影響。從響應面的最高點可以看出，在所選的范圍內存在極值，即是響應面的最高點。比較幾個圖可知，因素X3(提取時間)、X1(甲醇體積分數)對響應值的影響較大，表現為曲線比較陡，這與回歸分析的結果吻合。單純從橄欖苦苷提取率值的大小考慮，可以求得最適的提取條件為X1＝93.5%、X2＝1∶25、X3＝ 26min，預測橄欖苦苷的提取率為7.75%，在此條件下進行驗證實驗，重復3次，取平均值，提取液中橄欖苦苷的提取率為7.83%，與預測值相差1.4%。因此，基于響應曲面法所得到的優化工藝參數準確可靠。

3 結 論

本實驗使用超聲法從油橄欖葉中提取分離橄欖苦苷，通過單因素試驗，以及3因素3水平響應面分析試驗，建立了提取率與各影響因素之間的數學模型，根據此二次回歸模型，確定橄欖苦苷的最佳提取工藝參數：甲醇體積分數93.5%、料液比1∶25、提取時間26min，在此工藝條件下橄欖苦苷的實際提取率可達7.83%。因此，利用響應面分析方法對油橄欖葉中橄欖苦苷的提取工藝進行優化，可獲得最佳工藝參數，降低工藝操作的盲目性。

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Optimization of Ultrasound-Assisted Extraction Process for Oleuropein from Olea europaea Leaves by Response Surface Analysis

YAN Shu-jun，WANG Yuan，SU Yan-hong，RAO Zai-sheng，LI Hui*
(College of Chemical Engineering, Sichuan University, Chengdu 610065, China)

Objective∶ To find optimal process conditions for the ultrasound-assisted extraction of oleuropein from Olea europaea leaves. Methods∶ The effects of methanol concentration, solid-to-solvent ratio and extraction time on oleuropein yield were investigated by one-factor-at-a-time design. A three-factor, three-level Box-Behnken experimental design was employed to build a second-order polynomial regression equation. The obtained regression equation was analyzed by response surface analysis to optimize the three process conditions. Results∶ The optimal process conditions were as follows∶ methanol concentration of 93.5%, solid-to-solvent ratio of 1∶25 (g/mL) and an extraction time of 26 min. Conclusion∶ Under these conditions, the oleuropein yield from Olea europaea leaves was up to 7.83%.

Olea europaea leaves；oleuropein；ultrasound-assisted extraction；response surface methodology

TS201.1

A

1002-6630(2012)18-0073-04

2011-07-08

閆樹軍(1988—)，男，碩士研究生，研究方向為天然藥物提取與分離。E-mail：ysj512780817@163.com

*通信作者：李暉(1954—)，男，教授，博士，研究方向為藥學工藝學。E-mail：Lihuilab@sina.com