智舌快速檢測(cè)水產(chǎn)品中的麥?zhǔn)匣【?/h1>
2012-06-01 10:59:46陳春艷竇文超田師一王珍英樓芳芳趙廣英
食品科學(xué) 2012年18期
陳春艷，竇文超，田師一，王珍英，樓芳芳，趙廣英
智舌快速檢測(cè)水產(chǎn)品中的麥?zhǔn)匣【?/p>
陳春艷，竇文超，田師一，王珍英，樓芳芳，趙廣英*
(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310035)
探索仿生傳感器——智舌在麥?zhǔn)匣【焖贆z測(cè)中的可行性，以期構(gòu)建一種新型的水產(chǎn)品中致病性弧菌的快速檢測(cè)技術(shù)。用智舌結(jié)合主成分分析法對(duì)11種致病性弧菌的液體培養(yǎng)物進(jìn)行區(qū)分，以確定該法能否將11種致病性弧菌區(qū)分開及其所需的最短培養(yǎng)時(shí)間，并確定針對(duì)被測(cè)物的適宜電極和頻率段組合；然后用智舌結(jié)合簇類獨(dú)立軟模式識(shí)別法構(gòu)建麥?zhǔn)匣【呐袆e模型，并對(duì)判別模型進(jìn)行回判及驗(yàn)證，根據(jù)判別準(zhǔn)確率確定最佳判別模型，從而探索智舌結(jié)合簇類獨(dú)立軟模式識(shí)別法能否用來建立快速檢測(cè)麥?zhǔn)匣【臄?shù)據(jù)庫。結(jié)果顯示：當(dāng)弧菌在其特異性培養(yǎng)基中培養(yǎng)7h后，智舌能很好地將11種致病性弧菌區(qū)分開；6種電極與其頻率段組合下的判別模型對(duì)所有樣本的判別準(zhǔn)確率均達(dá)到了100%。說明所建模型可用于麥?zhǔn)匣【目焖俸Y檢。
智舌；麥?zhǔn)匣【淮仡惇?dú)立軟模式識(shí)別法；快速檢測(cè)
致病性弧菌是污染水產(chǎn)品最主要的病原菌，該類菌是許多國家進(jìn)出口水產(chǎn)品的必檢項(xiàng)目。麥契尼可夫弧菌(Vibrio metschnikovii)簡(jiǎn)稱麥?zhǔn)匣【?981年由Jacqes等首次分離得到，是國內(nèi)外學(xué)者公認(rèn)的12種致病性弧菌之一[1]。近年來各地陸續(xù)有從被感染病人、食品和飲用水源中分離到麥?zhǔn)匣【膱?bào)道[2-3]。據(jù)美國疾病控制中心(centers for disease control，CDC)腸道細(xì)菌及弧菌研究室報(bào)道，麥?zhǔn)匣【饕獊碓从谒础⑺a(chǎn)品、人類血液、尿液等，主要引起人類傷口感染和敗血癥，其危害性已引起有關(guān)研究機(jī)構(gòu)的密切關(guān)注[4]。
目前，電子舌已廣泛應(yīng)用于酒類、飲料、食品的品質(zhì)評(píng)定等領(lǐng)域[5-10]，但在微生物檢測(cè)方面尚處于起步階段，國內(nèi)外僅有少數(shù)幾篇報(bào)道[11-16]。例如2003年等[12]采用基于脈沖伏安法的電子舌良好地區(qū)分了6 種不同的微生物：一種酵母菌，兩種細(xì)菌和三種霉菌；2004年Legin等[14]采用由8個(gè)交叉敏感的傳感器和一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)pH電極組成的電位型電子舌分析模擬的典型的黑曲霉發(fā)酵溶液，結(jié)果顯示，電子舌能同時(shí)測(cè)定混合培養(yǎng)基中的銨、檸檬酸鹽和草酸鹽，精密度良好(誤差8%)；2010年Jorge等[16]構(gòu)建出利用電子舌同時(shí)檢測(cè)內(nèi)毒素和其他細(xì)菌溶解性污染物的新方法。智能型電子舌(簡(jiǎn)稱智舌)是一種新型電子舌，其是以傳感器陣列檢測(cè)樣品信息，結(jié)合模式識(shí)別以及專家數(shù)據(jù)庫對(duì)被測(cè)樣品整體性狀進(jìn)行分析的現(xiàn)代化儀器[17]。與其他國家開發(fā)的電子舌不同，智舌采用組合脈沖弛豫譜技術(shù)，使得其具有適用范圍廣、檢測(cè)速度快、響應(yīng)譜信息量大、傳感器使用壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。
不同種類的微生物所含酶系統(tǒng)及其代謝途徑不盡相同，所以在一定容積的培養(yǎng)基中，隨著微生物的生長(zhǎng)，液體培養(yǎng)物的整體性狀就會(huì)具有菌種的明顯整體特異性。而智舌能夠很好鑒別被測(cè)液體樣品的整體綜合信息。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將兩者結(jié)合，初步探討用智舌結(jié)合主成分分析法及簇類獨(dú)立軟模式識(shí)別法(soft independent modeling of class analogy，SIMCA)法，以麥?zhǔn)匣【鸀楸粰z菌，創(chuàng)建一種新型的食品微生物快速檢測(cè)技術(shù)。
1 材料與方法
1.1 材料、試劑與儀器
1.1.1 菌種
麥?zhǔn)匣【?Vibrio metschnikovii) MCCC 1H00048 (Vme1)、擬態(tài)弧菌(Vibrio mimicus) MCCC 1H00078(Vmi)、辛辛那提弧菌(Vibrio cincinnatiensis) MCCC 1H00030 (Vci)、河流弧菌(Vibrio fluvialis) MCCC 1H00045(Vfl)、創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus) MCCC 1H00066(Vv)標(biāo)準(zhǔn)菌株 國家海洋局第三海洋研究所；弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii) CGMCC 1.1613(Vfu)標(biāo)準(zhǔn)菌株 中國普通微生物菌種保藏管理中心；麥?zhǔn)匣【?Vibrio metschnikovii) ZJGSMC 1ME0901(Vme2)、ZJGSMC 1ME0902(Vme3)、ZJGSMC 1ME0903(Vme4)、ZJGSMC 1ME0904(Vme5)、霍利斯弧菌(Vibrio hollisae) ZJGSMC 1H0907(Vh)、海魚弧菌(Vibrio damsela)ZJGSMC 1D0901(Vd)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus) ZJGSMC 1P0901(Vp)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)ZJGSMC 1A0803(Va)、鯊魚弧菌(Vibrio carchariae)ZJGSMC 1C0903(Vca) 浙江工商大學(xué)食品安全快速檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室和食品微生物實(shí)驗(yàn)室。
上述各試驗(yàn)用菌株在本研究進(jìn)行之初都用生化反應(yīng)系統(tǒng)——API 20E或弧菌科生化鑒定管進(jìn)行菌種的鑒定確認(rèn)。
1.1.2 培養(yǎng)基
所用培養(yǎng)基為本實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)的麥?zhǔn)匣【x擇性鑒別培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱為VmeDM)，其配方為：蔗糖20g、酵母浸出粉5g、氯化鈉10g、膽酸鈉3g、牛膽粉5g、硫代硫酸鈉10g、檸檬酸鐵1g、美藍(lán)指示劑0.05g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL，pH(8.0±0.2)。
1.1.3 儀器
智舌由浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院感官實(shí)驗(yàn)室研制開發(fā)，為傳感器陣列、多頻脈沖掃描儀和電腦3部分組成的一種仿生傳感器。智舌的電極組陣列采用標(biāo)準(zhǔn)的3電極系統(tǒng)，直徑為Φ2mm的鉑電極、金電極、鈀電極、鈦電極、鎢電極及銀電極作為工作電極，1mm× 5mm的鉑柱電極作為輔助電極，參比電極為Ag/AgCl電極，外鹽橋使用飽和KCl，通過六通道多頻大幅脈沖信號(hào)激發(fā)采集裝置使工作電極逐個(gè)對(duì)溶液進(jìn)行多頻大幅脈沖伏安法掃描[18]。
智舌是在Winquist的脈沖伏安型電子舌的基礎(chǔ)上，對(duì)其激勵(lì)信號(hào)進(jìn)行了改進(jìn)與擴(kuò)充，增加了1、10、100Hz的脈沖頻率段。多頻脈沖的激勵(lì)方式，使三電極體系在反映物質(zhì)不同電勢(shì)下電化學(xué)特征的同時(shí)，還呈現(xiàn)了物質(zhì)在不同頻段下的響應(yīng)征。特別是對(duì)于混合物質(zhì)體系，由于不同的物質(zhì)組分在不同頻率下有各自特定的響應(yīng)信號(hào)，多頻脈沖伏安法比常規(guī)脈沖伏安法能夠提供更大量的檢測(cè)信息量。智舌相較于電位型電子舌的優(yōu)點(diǎn)在于電極不需要修飾，可循環(huán)使用；除了具有普通伏安型電子舌使用壽命較其他電子舌壽命長(zhǎng)，操作簡(jiǎn)單性能穩(wěn)定易智能化、使用壽命長(zhǎng)和成本低廉等獨(dú)有的特點(diǎn)外，它提取的有效信息量成倍的增多，增強(qiáng)了電子舌的辨識(shí)能力，尤其是在基體成分復(fù)雜的液體樣品更具優(yōu)勢(shì)。
1.2 方法
1.2.1 實(shí)驗(yàn)樣品的制備
菌株的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液：將菌株制成大約為1.5×106個(gè)細(xì)菌/mL的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液。
區(qū)分鑒別組樣品培養(yǎng)液的制備：所需菌種為Vme1及其他10種弧菌。分別取100μL的11種弧菌的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液轉(zhuǎn)種于盛有50mLVmeDM的錐形瓶中，每種弧菌配制4份菌懸液，37℃條件下同批搖床培養(yǎng)(轉(zhuǎn)速160r/ min)。每隔1h取出一批培養(yǎng)液(每批培養(yǎng)液含11種致病性弧菌，每種弧菌4份菌懸液，共44份菌懸液)，水浴100℃/20min滅活待測(cè)。
模式識(shí)別單元組訓(xùn)練集及檢驗(yàn)集樣品培養(yǎng)液的制備：所需菌種為Vme1、Vme2、Vme3及其他10種弧菌。分別取100μL上述14株弧菌的菌懸液轉(zhuǎn)種于盛有50mLVmeDM的錐形瓶中，37℃條件下同批搖床培養(yǎng)(轉(zhuǎn)速160r/min)8h后，水浴100℃/20min滅活待測(cè)。其中，實(shí)驗(yàn)樣本包括訓(xùn)練集和驗(yàn)證集，Vme1、Vme2、Vme3各培養(yǎng)12個(gè)樣本作為訓(xùn)練集，Vme4及其他10種菌各培養(yǎng)6個(gè)樣本，作為檢驗(yàn)集。
未知樣品的制備：所需菌種為Vme4、Vme5及其他10種弧菌。分別取100μL上述12株弧菌的菌懸液轉(zhuǎn)種于盛有50mLVmeDM的錐形瓶中(Vme4、Vme5各配制12份菌懸液，其他10種菌各培養(yǎng)8份菌懸液)，37℃條件下同批搖床培養(yǎng)(轉(zhuǎn)速160r/min)8h后，水浴100℃/ 20min滅活。由非實(shí)驗(yàn)者進(jìn)行編號(hào)，并記錄相應(yīng)的編號(hào)對(duì)應(yīng)的菌種名稱。實(shí)驗(yàn)者在不知樣品名稱的情況下用智舌檢測(cè)。
1.2.2 檢測(cè)方法
智舌所應(yīng)用的多頻大幅脈沖伏安法在l、10、100Hz脈沖下采集樣品的電化學(xué)信息，儀器的采集速率為每隔0.001s采一個(gè)點(diǎn)，對(duì)于采集的數(shù)據(jù)要選取特征值即每個(gè)相應(yīng)電流脈沖信號(hào)提取其最大、最小和兩個(gè)拐點(diǎn)共4個(gè)值組合進(jìn)行分析。多頻脈沖伏安法是以常規(guī)脈沖伏安法作為基元模式，增加了不同脈沖頻率段上的階段性變化，減短了常規(guī)脈沖伏安法的脈沖時(shí)間間隔。這不僅可以消除各個(gè)頻率間響應(yīng)遲滯的干擾，而且使智舌大大地增加了采集的信息量，具有特異性和非特異性體系均可適用、響應(yīng)速度快、響應(yīng)譜信息量大、適宜智能化的特點(diǎn)，能夠更好地反映微生物在液體培養(yǎng)基里的綜合信息[7]。
多頻脈沖參數(shù)設(shè)置為：起始電位1V；終止電位－1V；電平步進(jìn)100mV；數(shù)據(jù)庫Access；基準(zhǔn)電壓：1.235V。
將每個(gè)樣本的菌懸液分成相等的3份，智舌通過傳感器陣列分別用同樣的方法對(duì)這3份菌懸液進(jìn)行檢測(cè)分析，3次檢測(cè)結(jié)果得到3個(gè)行向量，對(duì)行向量求平均得到的數(shù)據(jù)即代表這一樣本的檢測(cè)結(jié)果。
1.2.3 分析方法
1.2.3.1 PCA法
智舌對(duì)致病性弧菌的區(qū)分鑒別研究采用主成分分析法(principal component analysis，PCA)法作為數(shù)據(jù)處理方法。提取電流采集信號(hào)的最大值、最小值和拐點(diǎn)值作為檢測(cè)樣品的變量，以行向量代表樣品，縱向量代表變量，把不同電極不同頻率段的數(shù)據(jù)分別保存成數(shù)據(jù)表格，進(jìn)行主成分分析。比較不同電極及頻率段的主成分得分圖，在二維和三維平面上比較各個(gè)電極在不同頻率段下對(duì)樣品的示蹤、區(qū)分效果，最終確定適宜的電極及其脈沖頻率段組合用于監(jiān)測(cè)目的菌生長(zhǎng)狀況、區(qū)分不同致病性弧菌。數(shù)據(jù)處理軟件采用SPSS 11.0。
1.2.3.2 SIMCA模式識(shí)別法
智舌結(jié)合SIMCA法構(gòu)建麥?zhǔn)匣【闹悄苣Ｊ阶R(shí)別單元采用SIMCA法作為其數(shù)據(jù)處理的方法。模式識(shí)別是化學(xué)計(jì)量學(xué)中定性分析的方法，即將樣本集按樣本的某種性質(zhì)(通常是隱含的)進(jìn)行分類及特征選取[19-20]。本實(shí)驗(yàn)中，SIMCA判別模型的建立主要有兩個(gè)步驟，第一步是對(duì)培訓(xùn)集樣本的智舌數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析，為每一個(gè)類建立一個(gè)PCA模型，即聚類；第二步以檢驗(yàn)集樣本去擬合PCA模型，用辨別率和預(yù)示率來評(píng)價(jià)模型的好壞。數(shù)據(jù)處理軟件：Unscrambler V9.1。
2 結(jié)果與分析
2.1 智舌對(duì)致病性弧菌的鑒別
在保證準(zhǔn)確性的基礎(chǔ)上，為盡量在短時(shí)間內(nèi)得到鑒別11種致病性弧菌的檢測(cè)結(jié)果，本研究用智舌分別對(duì)培養(yǎng)1、2、3、…、24h的致病性弧菌液體培養(yǎng)物進(jìn)行鑒別研究，再采用PCA對(duì)智舌采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到各電極及頻率段組合的主成分得分圖，對(duì)其進(jìn)行分析、比較區(qū)分辨識(shí)效果，確定能夠?qū)⒅虏⌒曰【鷧^(qū)分開的最短時(shí)間及最佳的電極及頻率段組合。結(jié)果顯示，當(dāng)實(shí)驗(yàn)菌株在特異性培養(yǎng)基中培養(yǎng)7h后，智舌的W電極(1、10Hz)、Ag(10、100Hz)、Au(100Hz)、Pd(100Hz)能夠很好地區(qū)分11種致病性弧菌液體培養(yǎng)物(圖1)。
圖1 智舌對(duì)11種致病性弧菌的主成分得分區(qū)分效果圖Fig.1 PCA score plot of 11 pathogenic vibrios distinguished by Smartongue
11種致病性弧菌都能被很好地區(qū)分開，且麥?zhǔn)匣【毡榕c其他10種致病性弧菌的距離較遠(yuǎn)。分析原因可能是本實(shí)驗(yàn)使用的培養(yǎng)基為麥?zhǔn)匣【奶禺愋耘囵B(yǎng)基，內(nèi)含蔗糖、硫代硫酸鈉及美藍(lán)，麥?zhǔn)匣【芾谜崽钱a(chǎn)生小分子有機(jī)酸，有機(jī)酸與硫代硫酸鈉等共同作用，會(huì)降低培養(yǎng)基的氧化還原電勢(shì)；而其他致病性弧菌皆氧化酶陽性，副溶血性弧菌和辛辛那提弧菌弧菌不能分解利用蔗糖，其他弧菌受到美藍(lán)抑制作用，表現(xiàn)為不生長(zhǎng)或生長(zhǎng)很弱。故麥?zhǔn)匣【鷮?duì)培養(yǎng)基的改變情況與其他菌對(duì)培養(yǎng)基的改變有顯著性差異，從而進(jìn)一步擴(kuò)大了麥?zhǔn)匣【后w培養(yǎng)物的菌種特異性。
綜上所述，當(dāng)實(shí)驗(yàn)菌株在麥?zhǔn)匣【禺愋耘囵B(yǎng)基中培養(yǎng)7h后，智舌能很好地區(qū)分11種致病性弧菌。本實(shí)驗(yàn)證明了智舌對(duì)該培養(yǎng)物的敏感性。
2.2 智舌結(jié)合SIMCA法構(gòu)建麥?zhǔn)匣【闹悄苣Ｊ阶R(shí)別單元
2.2.1 麥?zhǔn)匣【鶳CA判別模型的建立
在本實(shí)驗(yàn)中，取培養(yǎng)7h后的弧菌液體培養(yǎng)物作為研究對(duì)象，因?yàn)?.1節(jié)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)弧菌在麥?zhǔn)匣【奶禺愋耘囵B(yǎng)基中培養(yǎng)7h后，智舌能夠很好地將11種致病性弧菌區(qū)分開。
如1.2.1節(jié)所述，Vme1、Vme2、Vme3各培養(yǎng)12個(gè)樣本作為訓(xùn)練集，用于建立PCA判別模型，Vme4及其他10種菌各培養(yǎng)6個(gè)樣本，作為評(píng)價(jià)判別模型是否有效的檢驗(yàn)集。首先利用智舌檢測(cè)樣本培養(yǎng)液，得到菌懸液的整體綜合信息，提取電流采集信號(hào)的頂點(diǎn)值和拐點(diǎn)值作為被測(cè)樣品的變量值進(jìn)行主成分分析，通過交互驗(yàn)證建立麥?zhǔn)匣【腜CA模型。電極陣列有6種不同的電極，每種電極又有3個(gè)頻率段，掃描結(jié)果共18個(gè)組合，即18個(gè)PCA模型。首先由圖2篩選得到相對(duì)較好的PCA模型，再用訓(xùn)練集和檢驗(yàn)集樣本回判及驗(yàn)證PCA模型，從而確定最佳模型。
圖2 麥?zhǔn)匣【你y電極10Hz PCA 模型Fig.2 PCA model of Vibrio metschnikovii (Ag electrode in 10 Hz)
圖2A顯示了樣本點(diǎn)分散和差異，具有相同或相近性質(zhì)的樣本聚集在一起，而差異較明顯的樣本相互遠(yuǎn)離。圖2B表示各樣本點(diǎn)對(duì)相應(yīng)PCA模型的影響程度，由樣本點(diǎn)的杠桿值和殘差來決定。杠桿值是樣本點(diǎn)或變量在模型中投影點(diǎn)距模型中心的距離，表示的是單個(gè)樣本或變量與模型中其他樣本或變量的區(qū)別，和樣本點(diǎn)或變量對(duì)建立的模型的影響程度，值越大表示對(duì)模型的影響越大。殘差是樣本點(diǎn)或變量的觀察值與擬合值之差，表示了模型未能解釋的樣本點(diǎn)或變量的特征的量，其值越小模型擬合越好。因此，樣本在主成分排序圖中散開，且樣本點(diǎn)的殘差值和杠桿值都較小，表明模型中訓(xùn)練集選取的樣本具有代表性, 各模型擬合性較好。
2.2 PCA模型的回判與檢驗(yàn)
SIMCA是一種有監(jiān)督模式的識(shí)別方法，屬于二值判定方法，即樣本特征的判別結(jié)果只有兩種——是或否。本實(shí)驗(yàn)的目的是建立麥?zhǔn)匣【目焖贆z測(cè)方法，故將實(shí)驗(yàn)所用到的菌株分為兩類，即“是麥?zhǔn)匣【焙汀安皇躯準(zhǔn)匣【薄C A模型是否有效，需要用訓(xùn)練集和檢驗(yàn)集樣本擬合PCA模型，根據(jù)判別準(zhǔn)確率來評(píng)價(jià)模型的好壞，這時(shí)就需要用到識(shí)別率與拒絕率。所謂識(shí)別率就是考察某類樣品有多少落在該類模型的區(qū)域內(nèi)；而拒絕率是考察某類樣品模型對(duì)于其他不屬于該類的未知樣品的拒絕程度，即是否落在該類模型的區(qū)域外。如果PCA模型對(duì)同類樣品的識(shí)別率及對(duì)其他類樣品的拒絕率均達(dá)到100%，就表明PCA模型正確可靠，可用于判別分析未知樣本。
圖3 麥?zhǔn)匣【阢y電極10Hz頻率段下的PCA模型對(duì)訓(xùn)練集和檢驗(yàn)集樣本的判別結(jié)果Fig.3 Score plots for discrimination between Vibrio metschnikovii and other Vibrio species in training set and testing set by PCA model based on Ag electrode and 10 Hz
用訓(xùn)練集樣本——Vme1、Vme2、Vme3(PCA模型是利用這些數(shù)據(jù)建成的)和檢驗(yàn)集樣本——Vme4及其他10種治病性弧菌的樣本數(shù)據(jù)去回判PCA模型。圖3為回判結(jié)果，縱軸是樣本距模型的距離(S2/S0)，值越小表示對(duì)應(yīng)的分類模型能更好的描述樣本，樣本屬于該類的可能性高；橫軸為樣本杠桿值；圖中分別用一條垂直線和一條水平的直線給出了樣本到模型的距離和杠桿值在α＝0.05顯著水平下的域值，如圖3中兩直線與坐標(biāo)軸構(gòu)成的區(qū)域即為麥?zhǔn)匣【挠行^(qū)域，即落入該區(qū)域的樣品就被判別為麥?zhǔn)匣【｛準(zhǔn)匣【阢y電極10Hz頻率段下的PCA模型對(duì)訓(xùn)練集樣本和檢驗(yàn)集樣本的判別結(jié)果為：訓(xùn)練集樣本Vme1、Vme2、Vme3均落在了該模型的有效區(qū)域內(nèi)(共36個(gè)樣本)，即識(shí)別率為100%，說明該模型能完全識(shí)別訓(xùn)練集的自身類樣本；檢驗(yàn)集樣本Vme4落在了該模型的有效區(qū)域內(nèi)(共6個(gè)樣本)，即識(shí)別率100%，檢驗(yàn)集樣本Vv、Vca、Va、Vp、Vci、Vmi、Vd、Vh、Vfu、Vfl均落在模型的有效區(qū)域外(共60個(gè)樣本)，即拒絕率100%，說明該模型能完全識(shí)別檢驗(yàn)集中的自身類樣本，拒絕其他類樣本。
表1 麥?zhǔn)匣【腜CA模型對(duì)訓(xùn)練集和檢驗(yàn)集樣本的判別率Table 1 Discriminantion rate of training set and proving set discriminated by the PCA model of V. metschnikovii
如表1所示，麥?zhǔn)匣【赪(1、10Hz)、Ag(10、100Hz)、Au(100Hz)、Pd(100Hz)電極下的PCA模型能準(zhǔn)確地識(shí)別同類，拒絕他類，其判別準(zhǔn)確率均達(dá)到了100%，說明所建模型正確可靠，可用于未知樣品的歸類檢測(cè)。
圖4 麥?zhǔn)匣【阢y電極10Hz頻率段下的PCA模型未知樣本的判別結(jié)果Fig.4 Scores plot of unknown samples discriminanted by the PCA model of V. metschnikovii (the Ag electrode in 10 Hz)
2.3 SIMCA判別模型對(duì)未知樣本的檢測(cè)
為進(jìn)一步證明SIMCA判別模型的有效性，用表1中判別準(zhǔn)確率達(dá)到100%的判別模型對(duì)未知樣本進(jìn)行判別。本實(shí)驗(yàn)中用于檢測(cè)的未知樣本共有104個(gè)，其中麥?zhǔn)匣【?4個(gè)樣本，其他致病性弧菌共80個(gè)樣本點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)各模型對(duì)未知樣本的判別準(zhǔn)確率也均達(dá)到100%，說明表1中判別率為100%的模型是麥?zhǔn)匣【淖罴雅袆e模型，可以用來快速篩檢麥?zhǔn)匣【D6為麥?zhǔn)匣【你y電極10Hz判別模型判別11種致病性弧菌共104個(gè)樣本點(diǎn)的結(jié)果，所有樣本均被準(zhǔn)確判別，沒有錯(cuò)判。
3 結(jié) 論
智舌是一種以多頻大幅脈沖伏安法為基元模式的新型智能電子舌，與常規(guī)電子舌相比，智舌包含的有效信息量成倍增多，特別是對(duì)于混合物質(zhì)體系，由于不同的物質(zhì)組分在不同的頻率下會(huì)有各自特定的響應(yīng)信號(hào)，因此智舌能夠更全面更真實(shí)地反映樣品混合物質(zhì)體系的整體特征。本研究首次將智舌引入到麥?zhǔn)匣【目焖贆z測(cè)中，通過研究智舌檢測(cè)致病性微生物的原理，摸索和優(yōu)化檢測(cè)條件，對(duì)獲得的綜合信息采用最佳的統(tǒng)計(jì)分析和模式識(shí)別，建立了一種水產(chǎn)品中致病性弧菌的快速檢測(cè)新技術(shù)。結(jié)果表明，當(dāng)試驗(yàn)菌株在麥?zhǔn)匣【禺愋耘囵B(yǎng)基中培養(yǎng)7h后，智舌能很好地區(qū)分11種致病性弧菌，區(qū)分效果佳的電極及其頻率段組合為W(1、10Hz)、Ag(10、100Hz)、Au(100Hz)、Pd(100Hz) 電極。另外，智舌與SIMCA法相結(jié)合構(gòu)建的上述6個(gè)電極及頻率段組合下的判別模型能夠很好地鑒別被試菌株是否為麥?zhǔn)匣【渑袆e準(zhǔn)確率均為100%。由此可見，該法為一種成本低廉、快速簡(jiǎn)便的麥?zhǔn)匣【焖俸Y檢方法。本實(shí)驗(yàn)證明了智舌在實(shí)驗(yàn)室范圍內(nèi)可用于麥?zhǔn)匣【目焖贆z測(cè)，為智舌今后在食源性致病菌檢測(cè)方面的廣泛應(yīng)用提供了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)與理論依據(jù)。
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Rapid Detection of Vibrio metschnikovii by Smartongue
CHEN Chun-yan，DOU Wen-chao，TIAN Shi-yi，WANG Zhen-ying，LOU Fang-fang，ZHAO Guang-ying*
(College of Food Science and Biotechnology Engineering, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310035, China)
The availability of Smartongue, a bionic sensor, for rapid detection of Vibrio metschnikovii was explored with the aim of proposing a rapid way to detect Vibrio metschnikovii in aquatic products. Smartongue combined with principal component analysis was used to discriminate among liquid cultures of 11 pathogenic Vibrio species to determine the availability of the combined techniques and minimum culture time. Meanwhile, optimal combinations of electrode and frequency were determined and then discrimination models for the detection of Vibrio metschnikovii was set up by combined use of Smartongue and soft independent modeling of class analogy (SIMCA) and validated. Optimal discrimination models were determined for high recognition rates to discover if combined Smartongue and SIMCA could be available for establishing a database for rapid detection of Vibrio metschnikovii. Eleven species of pathogenic Vibrio cultured in specific media for 7 h were successfully discriminated using Smartongue technique. The discrimination models based on 6 combinations of electrode and frequency showed a recognition rate of 100% for all samples. In conclusion, Smarttongue combined with SIMCA is available for rapid detection of Vibrio metschnikovii.
Smartongue; Vibrio metschnikovii; soft independent modeling of class analogy (SIMCA); rapid detection
TS207.4
A
1002-6630(2012)18-0165-06
2011-07-18
國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA091806)；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(30571623)；
2010年度浙江省大學(xué)生科技成果推廣項(xiàng)目(新苗人才計(jì)劃)(2010R408051)
陳春艷(1986—)，女，碩士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。E-mail：ccytina@163.com
*通信作者：趙廣英(1960—)，女，教授，碩士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量安全快速檢測(cè)、人畜共患病和食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢測(cè)。E-mail：zhaogy-user@163.com
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陳春艷，竇文超，田師一，王珍英，樓芳芳，趙廣英
智舌快速檢測(cè)水產(chǎn)品中的麥?zhǔn)匣【?/p>
陳春艷，竇文超，田師一，王珍英，樓芳芳，趙廣英*
(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310035)
探索仿生傳感器——智舌在麥?zhǔn)匣【焖贆z測(cè)中的可行性，以期構(gòu)建一種新型的水產(chǎn)品中致病性弧菌的快速檢測(cè)技術(shù)。用智舌結(jié)合主成分分析法對(duì)11種致病性弧菌的液體培養(yǎng)物進(jìn)行區(qū)分，以確定該法能否將11種致病性弧菌區(qū)分開及其所需的最短培養(yǎng)時(shí)間，并確定針對(duì)被測(cè)物的適宜電極和頻率段組合；然后用智舌結(jié)合簇類獨(dú)立軟模式識(shí)別法構(gòu)建麥?zhǔn)匣【呐袆e模型，并對(duì)判別模型進(jìn)行回判及驗(yàn)證，根據(jù)判別準(zhǔn)確率確定最佳判別模型，從而探索智舌結(jié)合簇類獨(dú)立軟模式識(shí)別法能否用來建立快速檢測(cè)麥?zhǔn)匣【臄?shù)據(jù)庫。結(jié)果顯示：當(dāng)弧菌在其特異性培養(yǎng)基中培養(yǎng)7h后，智舌能很好地將11種致病性弧菌區(qū)分開；6種電極與其頻率段組合下的判別模型對(duì)所有樣本的判別準(zhǔn)確率均達(dá)到了100%。說明所建模型可用于麥?zhǔn)匣【目焖俸Y檢。
智舌；麥?zhǔn)匣【淮仡惇?dú)立軟模式識(shí)別法；快速檢測(cè)
致病性弧菌是污染水產(chǎn)品最主要的病原菌，該類菌是許多國家進(jìn)出口水產(chǎn)品的必檢項(xiàng)目。麥契尼可夫弧菌(Vibrio metschnikovii)簡(jiǎn)稱麥?zhǔn)匣【?981年由Jacqes等首次分離得到，是國內(nèi)外學(xué)者公認(rèn)的12種致病性弧菌之一[1]。近年來各地陸續(xù)有從被感染病人、食品和飲用水源中分離到麥?zhǔn)匣【膱?bào)道[2-3]。據(jù)美國疾病控制中心(centers for disease control，CDC)腸道細(xì)菌及弧菌研究室報(bào)道，麥?zhǔn)匣【饕獊碓从谒础⑺a(chǎn)品、人類血液、尿液等，主要引起人類傷口感染和敗血癥，其危害性已引起有關(guān)研究機(jī)構(gòu)的密切關(guān)注[4]。
目前，電子舌已廣泛應(yīng)用于酒類、飲料、食品的品質(zhì)評(píng)定等領(lǐng)域[5-10]，但在微生物檢測(cè)方面尚處于起步階段，國內(nèi)外僅有少數(shù)幾篇報(bào)道[11-16]。例如2003年等[12]采用基于脈沖伏安法的電子舌良好地區(qū)分了6 種不同的微生物：一種酵母菌，兩種細(xì)菌和三種霉菌；2004年Legin等[14]采用由8個(gè)交叉敏感的傳感器和一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)pH電極組成的電位型電子舌分析模擬的典型的黑曲霉發(fā)酵溶液，結(jié)果顯示，電子舌能同時(shí)測(cè)定混合培養(yǎng)基中的銨、檸檬酸鹽和草酸鹽，精密度良好(誤差8%)；2010年Jorge等[16]構(gòu)建出利用電子舌同時(shí)檢測(cè)內(nèi)毒素和其他細(xì)菌溶解性污染物的新方法。智能型電子舌(簡(jiǎn)稱智舌)是一種新型電子舌，其是以傳感器陣列檢測(cè)樣品信息，結(jié)合模式識(shí)別以及專家數(shù)據(jù)庫對(duì)被測(cè)樣品整體性狀進(jìn)行分析的現(xiàn)代化儀器[17]。與其他國家開發(fā)的電子舌不同，智舌采用組合脈沖弛豫譜技術(shù)，使得其具有適用范圍廣、檢測(cè)速度快、響應(yīng)譜信息量大、傳感器使用壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。
不同種類的微生物所含酶系統(tǒng)及其代謝途徑不盡相同，所以在一定容積的培養(yǎng)基中，隨著微生物的生長(zhǎng)，液體培養(yǎng)物的整體性狀就會(huì)具有菌種的明顯整體特異性。而智舌能夠很好鑒別被測(cè)液體樣品的整體綜合信息。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將兩者結(jié)合，初步探討用智舌結(jié)合主成分分析法及簇類獨(dú)立軟模式識(shí)別法(soft independent modeling of class analogy，SIMCA)法，以麥?zhǔn)匣【鸀楸粰z菌，創(chuàng)建一種新型的食品微生物快速檢測(cè)技術(shù)。
1 材料與方法
1.1 材料、試劑與儀器
1.1.1 菌種
麥?zhǔn)匣【?Vibrio metschnikovii) MCCC 1H00048 (Vme1)、擬態(tài)弧菌(Vibrio mimicus) MCCC 1H00078(Vmi)、辛辛那提弧菌(Vibrio cincinnatiensis) MCCC 1H00030 (Vci)、河流弧菌(Vibrio fluvialis) MCCC 1H00045(Vfl)、創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus) MCCC 1H00066(Vv)標(biāo)準(zhǔn)菌株 國家海洋局第三海洋研究所；弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii) CGMCC 1.1613(Vfu)標(biāo)準(zhǔn)菌株 中國普通微生物菌種保藏管理中心；麥?zhǔn)匣【?Vibrio metschnikovii) ZJGSMC 1ME0901(Vme2)、ZJGSMC 1ME0902(Vme3)、ZJGSMC 1ME0903(Vme4)、ZJGSMC 1ME0904(Vme5)、霍利斯弧菌(Vibrio hollisae) ZJGSMC 1H0907(Vh)、海魚弧菌(Vibrio damsela)ZJGSMC 1D0901(Vd)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus) ZJGSMC 1P0901(Vp)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)ZJGSMC 1A0803(Va)、鯊魚弧菌(Vibrio carchariae)ZJGSMC 1C0903(Vca) 浙江工商大學(xué)食品安全快速檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室和食品微生物實(shí)驗(yàn)室。
上述各試驗(yàn)用菌株在本研究進(jìn)行之初都用生化反應(yīng)系統(tǒng)——API 20E或弧菌科生化鑒定管進(jìn)行菌種的鑒定確認(rèn)。
1.1.2 培養(yǎng)基
所用培養(yǎng)基為本實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)的麥?zhǔn)匣【x擇性鑒別培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱為VmeDM)，其配方為：蔗糖20g、酵母浸出粉5g、氯化鈉10g、膽酸鈉3g、牛膽粉5g、硫代硫酸鈉10g、檸檬酸鐵1g、美藍(lán)指示劑0.05g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL，pH(8.0±0.2)。
1.1.3 儀器
智舌由浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院感官實(shí)驗(yàn)室研制開發(fā)，為傳感器陣列、多頻脈沖掃描儀和電腦3部分組成的一種仿生傳感器。智舌的電極組陣列采用標(biāo)準(zhǔn)的3電極系統(tǒng)，直徑為Φ2mm的鉑電極、金電極、鈀電極、鈦電極、鎢電極及銀電極作為工作電極，1mm× 5mm的鉑柱電極作為輔助電極，參比電極為Ag/AgCl電極，外鹽橋使用飽和KCl，通過六通道多頻大幅脈沖信號(hào)激發(fā)采集裝置使工作電極逐個(gè)對(duì)溶液進(jìn)行多頻大幅脈沖伏安法掃描[18]。
智舌是在Winquist的脈沖伏安型電子舌的基礎(chǔ)上，對(duì)其激勵(lì)信號(hào)進(jìn)行了改進(jìn)與擴(kuò)充，增加了1、10、100Hz的脈沖頻率段。多頻脈沖的激勵(lì)方式，使三電極體系在反映物質(zhì)不同電勢(shì)下電化學(xué)特征的同時(shí)，還呈現(xiàn)了物質(zhì)在不同頻段下的響應(yīng)征。特別是對(duì)于混合物質(zhì)體系，由于不同的物質(zhì)組分在不同頻率下有各自特定的響應(yīng)信號(hào)，多頻脈沖伏安法比常規(guī)脈沖伏安法能夠提供更大量的檢測(cè)信息量。智舌相較于電位型電子舌的優(yōu)點(diǎn)在于電極不需要修飾，可循環(huán)使用；除了具有普通伏安型電子舌使用壽命較其他電子舌壽命長(zhǎng)，操作簡(jiǎn)單性能穩(wěn)定易智能化、使用壽命長(zhǎng)和成本低廉等獨(dú)有的特點(diǎn)外，它提取的有效信息量成倍的增多，增強(qiáng)了電子舌的辨識(shí)能力，尤其是在基體成分復(fù)雜的液體樣品更具優(yōu)勢(shì)。
1.2 方法
1.2.1 實(shí)驗(yàn)樣品的制備
菌株的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液：將菌株制成大約為1.5×106個(gè)細(xì)菌/mL的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液。
區(qū)分鑒別組樣品培養(yǎng)液的制備：所需菌種為Vme1及其他10種弧菌。分別取100μL的11種弧菌的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液轉(zhuǎn)種于盛有50mLVmeDM的錐形瓶中，每種弧菌配制4份菌懸液，37℃條件下同批搖床培養(yǎng)(轉(zhuǎn)速160r/ min)。每隔1h取出一批培養(yǎng)液(每批培養(yǎng)液含11種致病性弧菌，每種弧菌4份菌懸液，共44份菌懸液)，水浴100℃/20min滅活待測(cè)。
模式識(shí)別單元組訓(xùn)練集及檢驗(yàn)集樣品培養(yǎng)液的制備：所需菌種為Vme1、Vme2、Vme3及其他10種弧菌。分別取100μL上述14株弧菌的菌懸液轉(zhuǎn)種于盛有50mLVmeDM的錐形瓶中，37℃條件下同批搖床培養(yǎng)(轉(zhuǎn)速160r/min)8h后，水浴100℃/20min滅活待測(cè)。其中，實(shí)驗(yàn)樣本包括訓(xùn)練集和驗(yàn)證集，Vme1、Vme2、Vme3各培養(yǎng)12個(gè)樣本作為訓(xùn)練集，Vme4及其他10種菌各培養(yǎng)6個(gè)樣本，作為檢驗(yàn)集。
未知樣品的制備：所需菌種為Vme4、Vme5及其他10種弧菌。分別取100μL上述12株弧菌的菌懸液轉(zhuǎn)種于盛有50mLVmeDM的錐形瓶中(Vme4、Vme5各配制12份菌懸液，其他10種菌各培養(yǎng)8份菌懸液)，37℃條件下同批搖床培養(yǎng)(轉(zhuǎn)速160r/min)8h后，水浴100℃/ 20min滅活。由非實(shí)驗(yàn)者進(jìn)行編號(hào)，并記錄相應(yīng)的編號(hào)對(duì)應(yīng)的菌種名稱。實(shí)驗(yàn)者在不知樣品名稱的情況下用智舌檢測(cè)。
1.2.2 檢測(cè)方法
智舌所應(yīng)用的多頻大幅脈沖伏安法在l、10、100Hz脈沖下采集樣品的電化學(xué)信息，儀器的采集速率為每隔0.001s采一個(gè)點(diǎn)，對(duì)于采集的數(shù)據(jù)要選取特征值即每個(gè)相應(yīng)電流脈沖信號(hào)提取其最大、最小和兩個(gè)拐點(diǎn)共4個(gè)值組合進(jìn)行分析。多頻脈沖伏安法是以常規(guī)脈沖伏安法作為基元模式，增加了不同脈沖頻率段上的階段性變化，減短了常規(guī)脈沖伏安法的脈沖時(shí)間間隔。這不僅可以消除各個(gè)頻率間響應(yīng)遲滯的干擾，而且使智舌大大地增加了采集的信息量，具有特異性和非特異性體系均可適用、響應(yīng)速度快、響應(yīng)譜信息量大、適宜智能化的特點(diǎn)，能夠更好地反映微生物在液體培養(yǎng)基里的綜合信息[7]。
多頻脈沖參數(shù)設(shè)置為：起始電位1V；終止電位－1V；電平步進(jìn)100mV；數(shù)據(jù)庫Access；基準(zhǔn)電壓：1.235V。
將每個(gè)樣本的菌懸液分成相等的3份，智舌通過傳感器陣列分別用同樣的方法對(duì)這3份菌懸液進(jìn)行檢測(cè)分析，3次檢測(cè)結(jié)果得到3個(gè)行向量，對(duì)行向量求平均得到的數(shù)據(jù)即代表這一樣本的檢測(cè)結(jié)果。
1.2.3 分析方法
1.2.3.1 PCA法
智舌對(duì)致病性弧菌的區(qū)分鑒別研究采用主成分分析法(principal component analysis，PCA)法作為數(shù)據(jù)處理方法。提取電流采集信號(hào)的最大值、最小值和拐點(diǎn)值作為檢測(cè)樣品的變量，以行向量代表樣品，縱向量代表變量，把不同電極不同頻率段的數(shù)據(jù)分別保存成數(shù)據(jù)表格，進(jìn)行主成分分析。比較不同電極及頻率段的主成分得分圖，在二維和三維平面上比較各個(gè)電極在不同頻率段下對(duì)樣品的示蹤、區(qū)分效果，最終確定適宜的電極及其脈沖頻率段組合用于監(jiān)測(cè)目的菌生長(zhǎng)狀況、區(qū)分不同致病性弧菌。數(shù)據(jù)處理軟件采用SPSS 11.0。
1.2.3.2 SIMCA模式識(shí)別法
智舌結(jié)合SIMCA法構(gòu)建麥?zhǔn)匣【闹悄苣Ｊ阶R(shí)別單元采用SIMCA法作為其數(shù)據(jù)處理的方法。模式識(shí)別是化學(xué)計(jì)量學(xué)中定性分析的方法，即將樣本集按樣本的某種性質(zhì)(通常是隱含的)進(jìn)行分類及特征選取[19-20]。本實(shí)驗(yàn)中，SIMCA判別模型的建立主要有兩個(gè)步驟，第一步是對(duì)培訓(xùn)集樣本的智舌數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析，為每一個(gè)類建立一個(gè)PCA模型，即聚類；第二步以檢驗(yàn)集樣本去擬合PCA模型，用辨別率和預(yù)示率來評(píng)價(jià)模型的好壞。數(shù)據(jù)處理軟件：Unscrambler V9.1。
2 結(jié)果與分析
2.1 智舌對(duì)致病性弧菌的鑒別
在保證準(zhǔn)確性的基礎(chǔ)上，為盡量在短時(shí)間內(nèi)得到鑒別11種致病性弧菌的檢測(cè)結(jié)果，本研究用智舌分別對(duì)培養(yǎng)1、2、3、…、24h的致病性弧菌液體培養(yǎng)物進(jìn)行鑒別研究，再采用PCA對(duì)智舌采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到各電極及頻率段組合的主成分得分圖，對(duì)其進(jìn)行分析、比較區(qū)分辨識(shí)效果，確定能夠?qū)⒅虏⌒曰【鷧^(qū)分開的最短時(shí)間及最佳的電極及頻率段組合。結(jié)果顯示，當(dāng)實(shí)驗(yàn)菌株在特異性培養(yǎng)基中培養(yǎng)7h后，智舌的W電極(1、10Hz)、Ag(10、100Hz)、Au(100Hz)、Pd(100Hz)能夠很好地區(qū)分11種致病性弧菌液體培養(yǎng)物(圖1)。
圖1 智舌對(duì)11種致病性弧菌的主成分得分區(qū)分效果圖Fig.1 PCA score plot of 11 pathogenic vibrios distinguished by Smartongue
11種致病性弧菌都能被很好地區(qū)分開，且麥?zhǔn)匣【毡榕c其他10種致病性弧菌的距離較遠(yuǎn)。分析原因可能是本實(shí)驗(yàn)使用的培養(yǎng)基為麥?zhǔn)匣【奶禺愋耘囵B(yǎng)基，內(nèi)含蔗糖、硫代硫酸鈉及美藍(lán)，麥?zhǔn)匣【芾谜崽钱a(chǎn)生小分子有機(jī)酸，有機(jī)酸與硫代硫酸鈉等共同作用，會(huì)降低培養(yǎng)基的氧化還原電勢(shì)；而其他致病性弧菌皆氧化酶陽性，副溶血性弧菌和辛辛那提弧菌弧菌不能分解利用蔗糖，其他弧菌受到美藍(lán)抑制作用，表現(xiàn)為不生長(zhǎng)或生長(zhǎng)很弱。故麥?zhǔn)匣【鷮?duì)培養(yǎng)基的改變情況與其他菌對(duì)培養(yǎng)基的改變有顯著性差異，從而進(jìn)一步擴(kuò)大了麥?zhǔn)匣【后w培養(yǎng)物的菌種特異性。
綜上所述，當(dāng)實(shí)驗(yàn)菌株在麥?zhǔn)匣【禺愋耘囵B(yǎng)基中培養(yǎng)7h后，智舌能很好地區(qū)分11種致病性弧菌。本實(shí)驗(yàn)證明了智舌對(duì)該培養(yǎng)物的敏感性。
2.2 智舌結(jié)合SIMCA法構(gòu)建麥?zhǔn)匣【闹悄苣Ｊ阶R(shí)別單元
2.2.1 麥?zhǔn)匣【鶳CA判別模型的建立
在本實(shí)驗(yàn)中，取培養(yǎng)7h后的弧菌液體培養(yǎng)物作為研究對(duì)象，因?yàn)?.1節(jié)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)弧菌在麥?zhǔn)匣【奶禺愋耘囵B(yǎng)基中培養(yǎng)7h后，智舌能夠很好地將11種致病性弧菌區(qū)分開。
如1.2.1節(jié)所述，Vme1、Vme2、Vme3各培養(yǎng)12個(gè)樣本作為訓(xùn)練集，用于建立PCA判別模型，Vme4及其他10種菌各培養(yǎng)6個(gè)樣本，作為評(píng)價(jià)判別模型是否有效的檢驗(yàn)集。首先利用智舌檢測(cè)樣本培養(yǎng)液，得到菌懸液的整體綜合信息，提取電流采集信號(hào)的頂點(diǎn)值和拐點(diǎn)值作為被測(cè)樣品的變量值進(jìn)行主成分分析，通過交互驗(yàn)證建立麥?zhǔn)匣【腜CA模型。電極陣列有6種不同的電極，每種電極又有3個(gè)頻率段，掃描結(jié)果共18個(gè)組合，即18個(gè)PCA模型。首先由圖2篩選得到相對(duì)較好的PCA模型，再用訓(xùn)練集和檢驗(yàn)集樣本回判及驗(yàn)證PCA模型，從而確定最佳模型。
圖2 麥?zhǔn)匣【你y電極10Hz PCA 模型Fig.2 PCA model of Vibrio metschnikovii (Ag electrode in 10 Hz)
圖2A顯示了樣本點(diǎn)分散和差異，具有相同或相近性質(zhì)的樣本聚集在一起，而差異較明顯的樣本相互遠(yuǎn)離。圖2B表示各樣本點(diǎn)對(duì)相應(yīng)PCA模型的影響程度，由樣本點(diǎn)的杠桿值和殘差來決定。杠桿值是樣本點(diǎn)或變量在模型中投影點(diǎn)距模型中心的距離，表示的是單個(gè)樣本或變量與模型中其他樣本或變量的區(qū)別，和樣本點(diǎn)或變量對(duì)建立的模型的影響程度，值越大表示對(duì)模型的影響越大。殘差是樣本點(diǎn)或變量的觀察值與擬合值之差，表示了模型未能解釋的樣本點(diǎn)或變量的特征的量，其值越小模型擬合越好。因此，樣本在主成分排序圖中散開，且樣本點(diǎn)的殘差值和杠桿值都較小，表明模型中訓(xùn)練集選取的樣本具有代表性, 各模型擬合性較好。
2.2 PCA模型的回判與檢驗(yàn)
SIMCA是一種有監(jiān)督模式的識(shí)別方法，屬于二值判定方法，即樣本特征的判別結(jié)果只有兩種——是或否。本實(shí)驗(yàn)的目的是建立麥?zhǔn)匣【目焖贆z測(cè)方法，故將實(shí)驗(yàn)所用到的菌株分為兩類，即“是麥?zhǔn)匣【焙汀安皇躯準(zhǔn)匣【薄C A模型是否有效，需要用訓(xùn)練集和檢驗(yàn)集樣本擬合PCA模型，根據(jù)判別準(zhǔn)確率來評(píng)價(jià)模型的好壞，這時(shí)就需要用到識(shí)別率與拒絕率。所謂識(shí)別率就是考察某類樣品有多少落在該類模型的區(qū)域內(nèi)；而拒絕率是考察某類樣品模型對(duì)于其他不屬于該類的未知樣品的拒絕程度，即是否落在該類模型的區(qū)域外。如果PCA模型對(duì)同類樣品的識(shí)別率及對(duì)其他類樣品的拒絕率均達(dá)到100%，就表明PCA模型正確可靠，可用于判別分析未知樣本。
圖3 麥?zhǔn)匣【阢y電極10Hz頻率段下的PCA模型對(duì)訓(xùn)練集和檢驗(yàn)集樣本的判別結(jié)果Fig.3 Score plots for discrimination between Vibrio metschnikovii and other Vibrio species in training set and testing set by PCA model based on Ag electrode and 10 Hz
用訓(xùn)練集樣本——Vme1、Vme2、Vme3(PCA模型是利用這些數(shù)據(jù)建成的)和檢驗(yàn)集樣本——Vme4及其他10種治病性弧菌的樣本數(shù)據(jù)去回判PCA模型。圖3為回判結(jié)果，縱軸是樣本距模型的距離(S2/S0)，值越小表示對(duì)應(yīng)的分類模型能更好的描述樣本，樣本屬于該類的可能性高；橫軸為樣本杠桿值；圖中分別用一條垂直線和一條水平的直線給出了樣本到模型的距離和杠桿值在α＝0.05顯著水平下的域值，如圖3中兩直線與坐標(biāo)軸構(gòu)成的區(qū)域即為麥?zhǔn)匣【挠行^(qū)域，即落入該區(qū)域的樣品就被判別為麥?zhǔn)匣【｛準(zhǔn)匣【阢y電極10Hz頻率段下的PCA模型對(duì)訓(xùn)練集樣本和檢驗(yàn)集樣本的判別結(jié)果為：訓(xùn)練集樣本Vme1、Vme2、Vme3均落在了該模型的有效區(qū)域內(nèi)(共36個(gè)樣本)，即識(shí)別率為100%，說明該模型能完全識(shí)別訓(xùn)練集的自身類樣本；檢驗(yàn)集樣本Vme4落在了該模型的有效區(qū)域內(nèi)(共6個(gè)樣本)，即識(shí)別率100%，檢驗(yàn)集樣本Vv、Vca、Va、Vp、Vci、Vmi、Vd、Vh、Vfu、Vfl均落在模型的有效區(qū)域外(共60個(gè)樣本)，即拒絕率100%，說明該模型能完全識(shí)別檢驗(yàn)集中的自身類樣本，拒絕其他類樣本。
表1 麥?zhǔn)匣【腜CA模型對(duì)訓(xùn)練集和檢驗(yàn)集樣本的判別率Table 1 Discriminantion rate of training set and proving set discriminated by the PCA model of V. metschnikovii
如表1所示，麥?zhǔn)匣【赪(1、10Hz)、Ag(10、100Hz)、Au(100Hz)、Pd(100Hz)電極下的PCA模型能準(zhǔn)確地識(shí)別同類，拒絕他類，其判別準(zhǔn)確率均達(dá)到了100%，說明所建模型正確可靠，可用于未知樣品的歸類檢測(cè)。
圖4 麥?zhǔn)匣【阢y電極10Hz頻率段下的PCA模型未知樣本的判別結(jié)果Fig.4 Scores plot of unknown samples discriminanted by the PCA model of V. metschnikovii (the Ag electrode in 10 Hz)
2.3 SIMCA判別模型對(duì)未知樣本的檢測(cè)
為進(jìn)一步證明SIMCA判別模型的有效性，用表1中判別準(zhǔn)確率達(dá)到100%的判別模型對(duì)未知樣本進(jìn)行判別。本實(shí)驗(yàn)中用于檢測(cè)的未知樣本共有104個(gè)，其中麥?zhǔn)匣【?4個(gè)樣本，其他致病性弧菌共80個(gè)樣本點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)各模型對(duì)未知樣本的判別準(zhǔn)確率也均達(dá)到100%，說明表1中判別率為100%的模型是麥?zhǔn)匣【淖罴雅袆e模型，可以用來快速篩檢麥?zhǔn)匣【D6為麥?zhǔn)匣【你y電極10Hz判別模型判別11種致病性弧菌共104個(gè)樣本點(diǎn)的結(jié)果，所有樣本均被準(zhǔn)確判別，沒有錯(cuò)判。
3 結(jié) 論
智舌是一種以多頻大幅脈沖伏安法為基元模式的新型智能電子舌，與常規(guī)電子舌相比，智舌包含的有效信息量成倍增多，特別是對(duì)于混合物質(zhì)體系，由于不同的物質(zhì)組分在不同的頻率下會(huì)有各自特定的響應(yīng)信號(hào)，因此智舌能夠更全面更真實(shí)地反映樣品混合物質(zhì)體系的整體特征。本研究首次將智舌引入到麥?zhǔn)匣【目焖贆z測(cè)中，通過研究智舌檢測(cè)致病性微生物的原理，摸索和優(yōu)化檢測(cè)條件，對(duì)獲得的綜合信息采用最佳的統(tǒng)計(jì)分析和模式識(shí)別，建立了一種水產(chǎn)品中致病性弧菌的快速檢測(cè)新技術(shù)。結(jié)果表明，當(dāng)試驗(yàn)菌株在麥?zhǔn)匣【禺愋耘囵B(yǎng)基中培養(yǎng)7h后，智舌能很好地區(qū)分11種致病性弧菌，區(qū)分效果佳的電極及其頻率段組合為W(1、10Hz)、Ag(10、100Hz)、Au(100Hz)、Pd(100Hz) 電極。另外，智舌與SIMCA法相結(jié)合構(gòu)建的上述6個(gè)電極及頻率段組合下的判別模型能夠很好地鑒別被試菌株是否為麥?zhǔn)匣【渑袆e準(zhǔn)確率均為100%。由此可見，該法為一種成本低廉、快速簡(jiǎn)便的麥?zhǔn)匣【焖俸Y檢方法。本實(shí)驗(yàn)證明了智舌在實(shí)驗(yàn)室范圍內(nèi)可用于麥?zhǔn)匣【目焖贆z測(cè)，為智舌今后在食源性致病菌檢測(cè)方面的廣泛應(yīng)用提供了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)與理論依據(jù)。
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Rapid Detection of Vibrio metschnikovii by Smartongue
CHEN Chun-yan，DOU Wen-chao，TIAN Shi-yi，WANG Zhen-ying，LOU Fang-fang，ZHAO Guang-ying*
(College of Food Science and Biotechnology Engineering, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310035, China)
The availability of Smartongue, a bionic sensor, for rapid detection of Vibrio metschnikovii was explored with the aim of proposing a rapid way to detect Vibrio metschnikovii in aquatic products. Smartongue combined with principal component analysis was used to discriminate among liquid cultures of 11 pathogenic Vibrio species to determine the availability of the combined techniques and minimum culture time. Meanwhile, optimal combinations of electrode and frequency were determined and then discrimination models for the detection of Vibrio metschnikovii was set up by combined use of Smartongue and soft independent modeling of class analogy (SIMCA) and validated. Optimal discrimination models were determined for high recognition rates to discover if combined Smartongue and SIMCA could be available for establishing a database for rapid detection of Vibrio metschnikovii. Eleven species of pathogenic Vibrio cultured in specific media for 7 h were successfully discriminated using Smartongue technique. The discrimination models based on 6 combinations of electrode and frequency showed a recognition rate of 100% for all samples. In conclusion, Smarttongue combined with SIMCA is available for rapid detection of Vibrio metschnikovii.
Smartongue; Vibrio metschnikovii; soft independent modeling of class analogy (SIMCA); rapid detection
TS207.4
A
1002-6630(2012)18-0165-06
2011-07-18
國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA091806)；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(30571623)；
2010年度浙江省大學(xué)生科技成果推廣項(xiàng)目(新苗人才計(jì)劃)(2010R408051)
陳春艷(1986—)，女，碩士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。E-mail：ccytina@163.com
*通信作者：趙廣英(1960—)，女，教授，碩士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量安全快速檢測(cè)、人畜共患病和食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢測(cè)。E-mail：zhaogy-user@163.com
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