智舌快速檢測水產品中的麥氏弧菌

陳春艷，竇文超，田師一，王珍英，樓芳芳，趙廣英

智舌快速檢測水產品中的麥氏弧菌

陳春艷，竇文超，田師一，王珍英，樓芳芳，趙廣英*

(浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江 杭州 310035)

探索仿生傳感器——智舌在麥氏弧菌快速檢測中的可行性，以期構建一種新型的水產品中致病性弧菌的快速檢測技術。用智舌結合主成分分析法對11種致病性弧菌的液體培養物進行區分，以確定該法能否將11種致病性弧菌區分開及其所需的最短培養時間，并確定針對被測物的適宜電極和頻率段組合；然后用智舌結合簇類獨立軟模式識別法構建麥氏弧菌的判別模型，并對判別模型進行回判及驗證，根據判別準確率確定最佳判別模型，從而探索智舌結合簇類獨立軟模式識別法能否用來建立快速檢測麥氏弧菌的數據庫。結果顯示：當弧菌在其特異性培養基中培養7h后，智舌能很好地將11種致病性弧菌區分開；6種電極與其頻率段組合下的判別模型對所有樣本的判別準確率均達到了100%。說明所建模型可用于麥氏弧菌的快速篩檢。

智舌；麥氏弧菌；簇類獨立軟模式識別法；快速檢測

致病性弧菌是污染水產品最主要的病原菌，該類菌是許多國家進出口水產品的必檢項目。麥契尼可夫弧菌(Vibrio metschnikovii)簡稱麥氏弧菌，于1981年由Jacqes等首次分離得到，是國內外學者公認的12種致病性弧菌之一[1]。近年來各地陸續有從被感染病人、食品和飲用水源中分離到麥氏弧菌的報道[2-3]。據美國疾病控制中心(centers for disease control，CDC)腸道細菌及弧菌研究室報道，麥氏弧菌主要來源于水源、水產品、人類血液、尿液等，主要引起人類傷口感染和敗血癥，其危害性已引起有關研究機構的密切關注[4]。

目前，電子舌已廣泛應用于酒類、飲料、食品的品質評定等領域[5-10]，但在微生物檢測方面尚處于起步階段，國內外僅有少數幾篇報道[11-16]。例如2003年等[12]采用基于脈沖伏安法的電子舌良好地區分了6 種不同的微生物：一種酵母菌，兩種細菌和三種霉菌；2004年Legin等[14]采用由8個交叉敏感的傳感器和一個標準pH電極組成的電位型電子舌分析模擬的典型的黑曲霉發酵溶液，結果顯示，電子舌能同時測定混合培養基中的銨、檸檬酸鹽和草酸鹽，精密度良好(誤差8%)；2010年Jorge等[16]構建出利用電子舌同時檢測內毒素和其他細菌溶解性污染物的新方法。智能型電子舌(簡稱智舌)是一種新型電子舌，其是以傳感器陣列檢測樣品信息，結合模式識別以及專家數據庫對被測樣品整體性狀進行分析的現代化儀器[17]。與其他國家開發的電子舌不同，智舌采用組合脈沖弛豫譜技術，使得其具有適用范圍廣、檢測速度快、響應譜信息量大、傳感器使用壽命長等優點。

不同種類的微生物所含酶系統及其代謝途徑不盡相同，所以在一定容積的培養基中，隨著微生物的生長，液體培養物的整體性狀就會具有菌種的明顯整體特異性。而智舌能夠很好鑒別被測液體樣品的整體綜合信息。本實驗設計將兩者結合，初步探討用智舌結合主成分分析法及簇類獨立軟模式識別法(soft independent modeling of class analogy，SIMCA)法，以麥氏弧菌為被檢菌，創建一種新型的食品微生物快速檢測技術。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 菌種

麥氏弧菌(Vibrio metschnikovii) MCCC 1H00048 (Vme1)、擬態弧菌(Vibrio mimicus) MCCC 1H00078(Vmi)、辛辛那提弧菌(Vibrio cincinnatiensis) MCCC 1H00030 (Vci)、河流弧菌(Vibrio fluvialis) MCCC 1H00045(Vfl)、創傷弧菌(Vibrio vulnificus) MCCC 1H00066(Vv)標準菌株 國家海洋局第三海洋研究所；弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii) CGMCC 1.1613(Vfu)標準菌株 中國普通微生物菌種保藏管理中心；麥氏弧菌(Vibrio metschnikovii) ZJGSMC 1ME0901(Vme2)、ZJGSMC 1ME0902(Vme3)、ZJGSMC 1ME0903(Vme4)、ZJGSMC 1ME0904(Vme5)、霍利斯弧菌(Vibrio hollisae) ZJGSMC 1H0907(Vh)、海魚弧菌(Vibrio damsela)ZJGSMC 1D0901(Vd)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus) ZJGSMC 1P0901(Vp)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)ZJGSMC 1A0803(Va)、鯊魚弧菌(Vibrio carchariae)ZJGSMC 1C0903(Vca) 浙江工商大學食品安全快速檢測實驗室和食品微生物實驗室。

上述各試驗用菌株在本研究進行之初都用生化反應系統——API 20E或弧菌科生化鑒定管進行菌種的鑒定確認。

1.1.2 培養基

所用培養基為本實驗室自主研發的麥氏弧菌選擇性鑒別培養基(簡稱為VmeDM)，其配方為：蔗糖20g、酵母浸出粉5g、氯化鈉10g、膽酸鈉3g、牛膽粉5g、硫代硫酸鈉10g、檸檬酸鐵1g、美藍指示劑0.05g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL，pH(8.0±0.2)。

1.1.3 儀器

智舌由浙江工商大學食品與生物工程學院感官實驗室研制開發，為傳感器陣列、多頻脈沖掃描儀和電腦3部分組成的一種仿生傳感器。智舌的電極組陣列采用標準的3電極系統，直徑為Φ2mm的鉑電極、金電極、鈀電極、鈦電極、鎢電極及銀電極作為工作電極，1mm× 5mm的鉑柱電極作為輔助電極，參比電極為Ag/AgCl電極，外鹽橋使用飽和KCl，通過六通道多頻大幅脈沖信號激發采集裝置使工作電極逐個對溶液進行多頻大幅脈沖伏安法掃描[18]。

智舌是在Winquist的脈沖伏安型電子舌的基礎上，對其激勵信號進行了改進與擴充，增加了1、10、100Hz的脈沖頻率段。多頻脈沖的激勵方式，使三電極體系在反映物質不同電勢下電化學特征的同時，還呈現了物質在不同頻段下的響應征。特別是對于混合物質體系，由于不同的物質組分在不同頻率下有各自特定的響應信號，多頻脈沖伏安法比常規脈沖伏安法能夠提供更大量的檢測信息量。智舌相較于電位型電子舌的優點在于電極不需要修飾，可循環使用；除了具有普通伏安型電子舌使用壽命較其他電子舌壽命長，操作簡單性能穩定易智能化、使用壽命長和成本低廉等獨有的特點外，它提取的有效信息量成倍的增多，增強了電子舌的辨識能力，尤其是在基體成分復雜的液體樣品更具優勢。

1.2 方法

1.2.1 實驗樣品的制備

菌株的標準培養液：將菌株制成大約為1.5×106個細菌/mL的標準培養液。

區分鑒別組樣品培養液的制備：所需菌種為Vme1及其他10種弧菌。分別取100μL的11種弧菌的標準培養液轉種于盛有50mLVmeDM的錐形瓶中，每種弧菌配制4份菌懸液，37℃條件下同批搖床培養(轉速160r/ min)。每隔1h取出一批培養液(每批培養液含11種致病性弧菌，每種弧菌4份菌懸液，共44份菌懸液)，水浴100℃/20min滅活待測。

模式識別單元組訓練集及檢驗集樣品培養液的制備：所需菌種為Vme1、Vme2、Vme3及其他10種弧菌。分別取100μL上述14株弧菌的菌懸液轉種于盛有50mLVmeDM的錐形瓶中，37℃條件下同批搖床培養(轉速160r/min)8h后，水浴100℃/20min滅活待測。其中，實驗樣本包括訓練集和驗證集，Vme1、Vme2、Vme3各培養12個樣本作為訓練集，Vme4及其他10種菌各培養6個樣本，作為檢驗集。

未知樣品的制備：所需菌種為Vme4、Vme5及其他10種弧菌。分別取100μL上述12株弧菌的菌懸液轉種于盛有50mLVmeDM的錐形瓶中(Vme4、Vme5各配制12份菌懸液，其他10種菌各培養8份菌懸液)，37℃條件下同批搖床培養(轉速160r/min)8h后，水浴100℃/ 20min滅活。由非實驗者進行編號，并記錄相應的編號對應的菌種名稱。實驗者在不知樣品名稱的情況下用智舌檢測。

1.2.2 檢測方法

智舌所應用的多頻大幅脈沖伏安法在l、10、100Hz脈沖下采集樣品的電化學信息，儀器的采集速率為每隔0.001s采一個點，對于采集的數據要選取特征值即每個相應電流脈沖信號提取其最大、最小和兩個拐點共4個值組合進行分析。多頻脈沖伏安法是以常規脈沖伏安法作為基元模式，增加了不同脈沖頻率段上的階段性變化，減短了常規脈沖伏安法的脈沖時間間隔。這不僅可以消除各個頻率間響應遲滯的干擾，而且使智舌大大地增加了采集的信息量，具有特異性和非特異性體系均可適用、響應速度快、響應譜信息量大、適宜智能化的特點，能夠更好地反映微生物在液體培養基里的綜合信息[7]。

多頻脈沖參數設置為：起始電位1V；終止電位－1V；電平步進100mV；數據庫Access；基準電壓：1.235V。

將每個樣本的菌懸液分成相等的3份，智舌通過傳感器陣列分別用同樣的方法對這3份菌懸液進行檢測分析，3次檢測結果得到3個行向量，對行向量求平均得到的數據即代表這一樣本的檢測結果。

1.2.3 分析方法

1.2.3.1 PCA法

智舌對致病性弧菌的區分鑒別研究采用主成分分析法(principal component analysis，PCA)法作為數據處理方法。提取電流采集信號的最大值、最小值和拐點值作為檢測樣品的變量，以行向量代表樣品，縱向量代表變量，把不同電極不同頻率段的數據分別保存成數據表格，進行主成分分析。比較不同電極及頻率段的主成分得分圖，在二維和三維平面上比較各個電極在不同頻率段下對樣品的示蹤、區分效果，最終確定適宜的電極及其脈沖頻率段組合用于監測目的菌生長狀況、區分不同致病性弧菌。數據處理軟件采用SPSS 11.0。

1.2.3.2 SIMCA模式識別法

智舌結合SIMCA法構建麥氏弧菌的智能模式識別單元采用SIMCA法作為其數據處理的方法。模式識別是化學計量學中定性分析的方法，即將樣本集按樣本的某種性質(通常是隱含的)進行分類及特征選取[19-20]。本實驗中，SIMCA判別模型的建立主要有兩個步驟，第一步是對培訓集樣本的智舌數據進行PCA分析，為每一個類建立一個PCA模型，即聚類；第二步以檢驗集樣本去擬合PCA模型，用辨別率和預示率來評價模型的好壞。數據處理軟件：Unscrambler V9.1。

2 結果與分析

2.1 智舌對致病性弧菌的鑒別

在保證準確性的基礎上，為盡量在短時間內得到鑒別11種致病性弧菌的檢測結果，本研究用智舌分別對培養1、2、3、…、24h的致病性弧菌液體培養物進行鑒別研究，再采用PCA對智舌采集的數據進行處理，得到各電極及頻率段組合的主成分得分圖，對其進行分析、比較區分辨識效果，確定能夠將致病性弧菌區分開的最短時間及最佳的電極及頻率段組合。結果顯示，當實驗菌株在特異性培養基中培養7h后，智舌的W電極(1、10Hz)、Ag(10、100Hz)、Au(100Hz)、Pd(100Hz)能夠很好地區分11種致病性弧菌液體培養物(圖1)。

圖1 智舌對11種致病性弧菌的主成分得分區分效果圖Fig.1 PCA score plot of 11 pathogenic vibrios distinguished by Smartongue

11種致病性弧菌都能被很好地區分開，且麥氏弧菌普遍與其他10種致病性弧菌的距離較遠。分析原因可能是本實驗使用的培養基為麥氏弧菌的特異性培養基，內含蔗糖、硫代硫酸鈉及美藍，麥氏弧菌能利用蔗糖產生小分子有機酸，有機酸與硫代硫酸鈉等共同作用，會降低培養基的氧化還原電勢；而其他致病性弧菌皆氧化酶陽性，副溶血性弧菌和辛辛那提弧菌弧菌不能分解利用蔗糖，其他弧菌受到美藍抑制作用，表現為不生長或生長很弱。故麥氏弧菌對培養基的改變情況與其他菌對培養基的改變有顯著性差異，從而進一步擴大了麥氏弧菌液體培養物的菌種特異性。

綜上所述，當實驗菌株在麥氏弧菌特異性培養基中培養7h后，智舌能很好地區分11種致病性弧菌。本實驗證明了智舌對該培養物的敏感性。

2.2 智舌結合SIMCA法構建麥氏弧菌的智能模式識別單元

2.2.1 麥氏弧菌PCA判別模型的建立

在本實驗中，取培養7h后的弧菌液體培養物作為研究對象，因為2.1節的實驗結果表明當弧菌在麥氏弧菌的特異性培養基中培養7h后，智舌能夠很好地將11種致病性弧菌區分開。

如1.2.1節所述，Vme1、Vme2、Vme3各培養12個樣本作為訓練集，用于建立PCA判別模型，Vme4及其他10種菌各培養6個樣本，作為評價判別模型是否有效的檢驗集。首先利用智舌檢測樣本培養液，得到菌懸液的整體綜合信息，提取電流采集信號的頂點值和拐點值作為被測樣品的變量值進行主成分分析，通過交互驗證建立麥氏弧菌的PCA模型。電極陣列有6種不同的電極，每種電極又有3個頻率段，掃描結果共18個組合，即18個PCA模型。首先由圖2篩選得到相對較好的PCA模型，再用訓練集和檢驗集樣本回判及驗證PCA模型，從而確定最佳模型。

圖2 麥氏弧菌的銀電極10Hz PCA 模型Fig.2 PCA model of Vibrio metschnikovii (Ag electrode in 10 Hz)

圖2A顯示了樣本點分散和差異，具有相同或相近性質的樣本聚集在一起，而差異較明顯的樣本相互遠離。圖2B表示各樣本點對相應PCA模型的影響程度，由樣本點的杠桿值和殘差來決定。杠桿值是樣本點或變量在模型中投影點距模型中心的距離，表示的是單個樣本或變量與模型中其他樣本或變量的區別，和樣本點或變量對建立的模型的影響程度，值越大表示對模型的影響越大。殘差是樣本點或變量的觀察值與擬合值之差，表示了模型未能解釋的樣本點或變量的特征的量，其值越小模型擬合越好。因此，樣本在主成分排序圖中散開，且樣本點的殘差值和杠桿值都較小，表明模型中訓練集選取的樣本具有代表性, 各模型擬合性較好。

2.2 PCA模型的回判與檢驗

SIMCA是一種有監督模式的識別方法，屬于二值判定方法，即樣本特征的判別結果只有兩種——是或否。本實驗的目的是建立麥氏弧菌的快速檢測方法，故將實驗所用到的菌株分為兩類，即“是麥氏弧菌”和“不是麥氏弧菌”。PC A模型是否有效，需要用訓練集和檢驗集樣本擬合PCA模型，根據判別準確率來評價模型的好壞，這時就需要用到識別率與拒絕率。所謂識別率就是考察某類樣品有多少落在該類模型的區域內；而拒絕率是考察某類樣品模型對于其他不屬于該類的未知樣品的拒絕程度，即是否落在該類模型的區域外。如果PCA模型對同類樣品的識別率及對其他類樣品的拒絕率均達到100%，就表明PCA模型正確可靠，可用于判別分析未知樣本。

圖3 麥氏弧菌在銀電極10Hz頻率段下的PCA模型對訓練集和檢驗集樣本的判別結果Fig.3 Score plots for discrimination between Vibrio metschnikovii and other Vibrio species in training set and testing set by PCA model based on Ag electrode and 10 Hz

用訓練集樣本——Vme1、Vme2、Vme3(PCA模型是利用這些數據建成的)和檢驗集樣本——Vme4及其他10種治病性弧菌的樣本數據去回判PCA模型。圖3為回判結果，縱軸是樣本距模型的距離(S2/S0)，值越小表示對應的分類模型能更好的描述樣本，樣本屬于該類的可能性高；橫軸為樣本杠桿值；圖中分別用一條垂直線和一條水平的直線給出了樣本到模型的距離和杠桿值在α＝0.05顯著水平下的域值，如圖3中兩直線與坐標軸構成的區域即為麥氏弧菌的有效區域，即落入該區域的樣品就被判別為麥氏弧菌。麥氏弧菌在銀電極10Hz頻率段下的PCA模型對訓練集樣本和檢驗集樣本的判別結果為：訓練集樣本Vme1、Vme2、Vme3均落在了該模型的有效區域內(共36個樣本)，即識別率為100%，說明該模型能完全識別訓練集的自身類樣本；檢驗集樣本Vme4落在了該模型的有效區域內(共6個樣本)，即識別率100%，檢驗集樣本Vv、Vca、Va、Vp、Vci、Vmi、Vd、Vh、Vfu、Vfl均落在模型的有效區域外(共60個樣本)，即拒絕率100%，說明該模型能完全識別檢驗集中的自身類樣本，拒絕其他類樣本。

表1 麥氏弧菌的PCA模型對訓練集和檢驗集樣本的判別率Table 1 Discriminantion rate of training set and proving set discriminated by the PCA model of V. metschnikovii

如表1所示，麥氏弧菌在W(1、10Hz)、Ag(10、100Hz)、Au(100Hz)、Pd(100Hz)電極下的PCA模型能準確地識別同類，拒絕他類，其判別準確率均達到了100%，說明所建模型正確可靠，可用于未知樣品的歸類檢測。

圖4 麥氏弧菌在銀電極10Hz頻率段下的PCA模型未知樣本的判別結果Fig.4 Scores plot of unknown samples discriminanted by the PCA model of V. metschnikovii (the Ag electrode in 10 Hz)

2.3 SIMCA判別模型對未知樣本的檢測

為進一步證明SIMCA判別模型的有效性，用表1中判別準確率達到100%的判別模型對未知樣本進行判別。本實驗中用于檢測的未知樣本共有104個，其中麥氏弧菌24個樣本，其他致病性弧菌共80個樣本點。結果發現各模型對未知樣本的判別準確率也均達到100%，說明表1中判別率為100%的模型是麥氏弧菌的最佳判別模型，可以用來快速篩檢麥氏弧菌。圖6為麥氏弧菌的銀電極10Hz判別模型判別11種致病性弧菌共104個樣本點的結果，所有樣本均被準確判別，沒有錯判。

3 結 論

智舌是一種以多頻大幅脈沖伏安法為基元模式的新型智能電子舌，與常規電子舌相比，智舌包含的有效信息量成倍增多，特別是對于混合物質體系，由于不同的物質組分在不同的頻率下會有各自特定的響應信號，因此智舌能夠更全面更真實地反映樣品混合物質體系的整體特征。本研究首次將智舌引入到麥氏弧菌的快速檢測中，通過研究智舌檢測致病性微生物的原理，摸索和優化檢測條件，對獲得的綜合信息采用最佳的統計分析和模式識別，建立了一種水產品中致病性弧菌的快速檢測新技術。結果表明，當試驗菌株在麥氏弧菌特異性培養基中培養7h后，智舌能很好地區分11種致病性弧菌，區分效果佳的電極及其頻率段組合為W(1、10Hz)、Ag(10、100Hz)、Au(100Hz)、Pd(100Hz) 電極。另外，智舌與SIMCA法相結合構建的上述6個電極及頻率段組合下的判別模型能夠很好地鑒別被試菌株是否為麥氏弧菌，其判別準確率均為100%。由此可見，該法為一種成本低廉、快速簡便的麥氏弧菌快速篩檢方法。本實驗證明了智舌在實驗室范圍內可用于麥氏弧菌的快速檢測，為智舌今后在食源性致病菌檢測方面的廣泛應用提供了良好的實驗基礎與理論依據。

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Rapid Detection of Vibrio metschnikovii by Smartongue

CHEN Chun-yan，DOU Wen-chao，TIAN Shi-yi，WANG Zhen-ying，LOU Fang-fang，ZHAO Guang-ying*
(College of Food Science and Biotechnology Engineering, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310035, China)

The availability of Smartongue, a bionic sensor, for rapid detection of Vibrio metschnikovii was explored with the aim of proposing a rapid way to detect Vibrio metschnikovii in aquatic products. Smartongue combined with principal component analysis was used to discriminate among liquid cultures of 11 pathogenic Vibrio species to determine the availability of the combined techniques and minimum culture time. Meanwhile, optimal combinations of electrode and frequency were determined and then discrimination models for the detection of Vibrio metschnikovii was set up by combined use of Smartongue and soft independent modeling of class analogy (SIMCA) and validated. Optimal discrimination models were determined for high recognition rates to discover if combined Smartongue and SIMCA could be available for establishing a database for rapid detection of Vibrio metschnikovii. Eleven species of pathogenic Vibrio cultured in specific media for 7 h were successfully discriminated using Smartongue technique. The discrimination models based on 6 combinations of electrode and frequency showed a recognition rate of 100% for all samples. In conclusion, Smarttongue combined with SIMCA is available for rapid detection of Vibrio metschnikovii.

Smartongue; Vibrio metschnikovii; soft independent modeling of class analogy (SIMCA); rapid detection

TS207.4

A

1002-6630(2012)18-0165-06

2011-07-18

國家“863”計劃項目(2007AA091806)；國家自然科學基金面上項目(30571623)；

2010年度浙江省大學生科技成果推廣項目(新苗人才計劃)(2010R408051)

陳春艷(1986—)，女，碩士，研究方向為食品質量與安全。E-mail：ccytina@163.com

*通信作者：趙廣英(1960—)，女，教授，碩士，研究方向為食品質量安全快速檢測、人畜共患病和食品衛生微生物學檢測。E-mail：zhaogy-user@163.com