小葉丁香的組織培養

冷強，張竹

（1.海林市園林管理站，黑龍江 海林 157100；2.大慶醫學高等專科學校）

丁香常用的繁殖方法有播種、嫁接和扦插等，但由于播種繁殖發芽率低，嫁接繁殖成活率較低，扦插繁殖的繁殖系數小、周期長，均難以滿足市場對種苗的需求。本文旨在探討通過植物組織培養方法獲得小葉丁香的種苗以供園林綠化使用，也為同種植物的組織培養提供一定的理論和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

取小葉丁香的莖段、葉片為外植體進行組織培養，小葉丁香母株取于牡丹江師范學院植物園。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的滅菌

取小葉丁香的莖和葉片流水沖洗1h，在0.1%升汞中滅菌30s、1min、2min，或在65%次氯酸鈉中滅菌1min、2min、3min，滅菌后將小葉丁香的莖（帶腋芽部分）剪成1～2cm的段狀插入不同的培養基中，將葉片剪成（1×1）cm2大小，平放于不同的脫分化 MS培養基中培養。

1.2.2 外植體的脫分化培養

小葉丁香的葉片消毒后，用無菌水沖洗5～6次，無菌吸水紙吸干表面水分，切成（1×1）cm2，分別接入以下培養基中，每種培養基接外植體50個。

A：MS＋6－BA4mg／L＋NAA2mg／L

B：MS＋6－BA3mg／L＋NAA2mg／L

C：MS＋6－BA2.5mg／L＋NAA2mg／L

D：MS＋6－BA2mg／L＋NAA2mg／L

E：MS＋6－BA1.5mg／L＋NAA2mg／L

F：MS＋6－BA1mg／L＋NAA2mg／L

G：MS＋6－BA0.5mg／L＋NAA2mg／L

1.2.3 小葉丁香腋芽的促生

取小葉丁香的莖段在65%的次氯酸鈉中浸泡2min滅菌之后，用無菌水沖洗5～6次，然后用無菌吸水紙吸干表面水分，切成1～2cm的莖段然后分別接入含有不同濃度6－BA的 MS培養基中（具體濃度見表4），并定時觀察。

1.2.4 生根培養

在無菌實驗臺上將上一步小葉丁香莖段所促生出的腋芽切下，分別接入含有不同濃度NAA的MS培養基中進行生根培養（具體濃度見表5），并定時觀察。

1.2.5 培養條件

光培養25℃﹑6000 lx、14h光照／10h黑暗。

2 結果與分析

2.1 不同消毒液及不同消毒時間對小葉丁香外植體的影響

為篩選出最佳的滅菌方法，我們采用不同滅菌劑及不同滅菌時間對小葉丁香外植體進行滅菌。試驗結果表明：莖和葉片在0.1%的升汞中滅菌30s時其生長情況最佳，長菌率為0，滅菌1min和2min時，雖然長菌率也為0，但是會引起外植體的死亡；莖在65%的次氯酸鈉中滅菌2min時，外植體的滅菌效果最好，葉片在次氯酸鈉中的最佳滅菌時間為1min。因為升汞對外植體的毒害情況比次氯酸鈉更嚴重（見表1、表2），因此莖段的最佳滅菌條件為次氯酸鈉滅菌2min，葉片最佳滅菌條件為次氯酸鈉滅菌1min。

表1 以0.1%升汞為消毒液對小葉丁香外植體最佳消毒時間的篩選

表2 以65%的次氯酸鈉為消毒液對小葉丁香外植體最佳消毒時間的篩選

2.2 最佳脫分化培養基的篩選

取小葉丁香的葉片在65%次氯酸鈉中滅菌1min，無菌水沖洗5～6次，然后用無菌吸水紙吸干表面水分，切成（1×1）cm2大小，分別接入不同的脫分化培養基中培養，每種培養基接種30片。試驗結果表明：隨著6－BA的濃度遞減，脫分化率有先增加后減少的趨勢，其中A、F、G號培養基中，外植體均沒有脫分化，說明6－BA濃度過高或過低都會影響外植體的脫分化；在D號培養基中 （MS＋6－BA2mg／L＋NAA2mg／L）外植體的脫分化率最高為13.3%。總體來看外植體的脫分化率較低，而且出現了褐化現象。褐化現象受很多因素的影響，例如：外植體的基因型、生理狀態、大小、種類，光照等等［1－2］。由表3可見，不同的激素濃度對外植體褐化的影響程度不同，其中A、F、G號培養基上外植體褐化最嚴重，全部外植體均發生褐化。

表3 培養基對小葉丁香葉片脫分化的影響

2.3 小葉丁香莖段最佳腋芽促生培養基的篩選

取小葉丁香的莖在65%的次氯酸鈉中浸泡2min滅菌后，用無菌水沖洗5～6次，然后用無菌吸水紙吸干表面水分，切成帶腋芽的約1～2cm長的莖段，分別接入以下培養基中培養，試驗結果表明：隨著6－BA濃度的增加，不僅促生的腋芽數有所增加而且促生腋芽的時間有所縮短，說明6－BA有誘導促生腋芽的良好作用，但這一濃度高于2mg／L時出現下降趨勢，確定以莖段促生腋芽的最適培養基為MS＋6－BA2mg／L。

表4 不同培養基對莖段生腋芽的影響

2.4 最適生根培養基的篩選

在超凈工作臺上將由小葉丁香莖段促生得到腋芽切下，接入含有不同濃度NAA的MS培養基中進行生根培養，并定時觀察。試驗結果如下：隨著NAA濃度的增加，腋芽生根率增加而且發根時間縮短，說明NAA的確有誘導生根的良好作用，當NAA濃度高于0.5mg／L時，生根率呈現下降趨勢。試驗確定腋芽生根最適培養基為 MS＋NAA0.5mg／L。

表5 不同濃度NAA的MS培養基對腋芽生根的影響

3 結論

3.1 試驗結果表明：莖段在0.1%的升汞中浸泡30s后生長情況最佳，長菌率為0%如果時間太長會發生組織的損傷從而引起褐化，而在65%的次氯酸鈉中浸泡2min其滅菌最徹底；葉片在0.1%的升汞中浸泡30s后生長情況最佳，在65%的次氯酸鈉中浸泡1min生長情況最佳；由于升汞對外植體的毒害比次氯酸鈉更嚴重，所以我們在對外植體滅菌時一般使用次氯酸鈉；

3.2 小葉丁香葉片脫分化最佳培養基為 MS＋NAA2mg／L＋6－BA2mg／L；

3.3 小葉丁香莖段生腋芽最佳培養基為 MS＋6－BA2mg／L；

3.4 小葉丁香腋芽生根最佳培養基為MS＋NAA 0.5 mg／L。

圖1 小葉丁香葉片愈傷組織的發生情況圖

圖2 小葉丁香腋芽的生根情況

［1］曾鐳，劉燕.植物組織培養中褐化問題的研究進展［J］.安徽農學通報，2007，13（14）：49－50.

［2］王棟，買合木提·克衣木，玉永雄，等.植物組織培養中的褐化現象及其防止措施［J］.黑龍江農業科學，2008（1）：7－10.