基于SNP標記的種子純度高效檢測分析模型的建立

李歐靜，張桂華，蘭青闊 ，王 永 ，趙 新 ，朱 珠 ，陳 銳，郭永澤

（1.天津市農業質量標準與檢測技術研究所，天津 300381；2.天津科潤農業科技股份有限公司，天津 300192）

蔬菜種子純度是種子質量的重要指標，其鑒定方法有田間形態試驗、RAPD、SSR、同工酶標記等，但這些方法在操作性、穩定性、多態性等方面不能滿足目前的需要。單核苷酸多態性（Single nucleotide polymorphism，SNP）是指基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。近年來，SNP標記以其二態性、等位基因性、高密度性以及高遺傳穩定性等優點成為研究熱點，被廣泛應用于農作物遺傳學研究[1]和品種鑒定當中[2]。

焦磷酸測序技術（Pyrosequencing）是實時、定量分析DNA序列的新一代測序技術，是基于引物引導的多聚酶延伸下的核酸合成的新型DNA測序技術[3]，具有操作簡單、費用低、通量高、結果準確和自動化程度高等優點，特別適合SNP、small InDel等短序列分析，具有較高的靈敏性和準確性。Pyrosequencing技術的另一突出優勢在于與DNA池（DNA Pooling）技術的結合應用。Pooling技術的原理是將已知對照樣本和多個未知樣本混合在一起進行PCR擴增，PCR產物經基因分型、最后用統計學方法對數據進行分析，得到已知樣本在總樣本中的比例[4]。Pyrosequencing和Pooling聯用技術兼有Pyrosequencing的定量測序優點和Pooling高通量的優點，特別適用于大規模樣品的等位基因頻率分析[5]，能滿足種子純度鑒定大樣本量的需求。

筆者分析了黃瓜SNP位點CLA13（C/G）在16個黃瓜育種材料中的多態性，結合Pyrosequencing和DNA Pooling技術，建立3Pooling SNP Pyrosequencing標準曲線，快速、高效的鑒定黃瓜種子純度，旨在為后續的品種鑒定及大批量的蔬菜種子純度鑒定奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料：16個黃瓜雜交種及其母本、父本的基因組DNA由天津科潤農業科技股份有限公司黃瓜研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 SNP位點的選擇及引物設計 經網絡數據庫檢索、驗證獲得黃瓜SNP位點CLA13（C/G），利用PSQ Assay Design軟件設計用于焦磷酸測序的PCR引物、測序引物以及需要分析的目標序列（Sequence to Analyze），其中前引物5’加生物素（Biotin）標記修飾見表1。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 CLA13（C/G）位點焦磷酸測序引物序列

1.2.2 焦磷酸測序反應 包括用于制備測序反應模板的PCR擴增和焦磷酸測序反應[6]。PCR擴增采用50μL反應體系，其中2×GoTaq Green Master Mix（Promega）25μL，上下游引物（10 μmol/L）各 1μL，DNA模板100 ng，滅菌去離子水補足至50μL。反應程序為94℃預變性5min；50個循環反應（94℃30 s，50℃ 30 s，72℃ 40 s）；72℃延伸 7 min；4℃保存。PCR儀為ABIverity 96 well Thermal cycler。

焦磷酸測序反應在PyroMark ID焦磷酸測序儀（Biotage）上進行。PCR產物中加入47μL Binding buffer（Biotage）和 3 μL Sepharose beads（Biotage），1 300 r/min渦旋混勻 15 min，經 Vacuum prep workstation單鏈分離，釋放到預先加入38.8μL Annealing buffer（Biotage）和1.2μL測序引物（10 μmol/L）的PSQ 96測序反應板中，80℃金屬加熱塊（Labnet）上加熱2min后冷卻至室溫。將酶、底物和A、T、C、G 成分（Qiagen）加入試劑倉，即可上機測序。測序結果可通過分型分析模式（Genotyping）直接獲得樣品SNP類型，或者通過等位基因頻率AQ（Allele Quantification）模式分析C基因型頻率C%和G基因型頻率G%。

1.2.3 DNA Pooling最適數量的確定 取3號雜交種（基因型記為C/G）及其父本（基因型記為C/C）基因組DNA，精確稀釋至20 ng/μL，按照C/C與C/G 的比例為 1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9 和1∶19 進行混合，模擬 2、3、4、5、6、7、8、9、10、20 個雜交種Pooling中混雜1個C/C的情況。將上述10種充分混勻DNA模板進行PCR擴增及焦磷酸測序分析，獲得C等位基因頻率C%和G等位基因頻率G%（G%=1-C%）。試驗設置10次重復。

1.2.4 3 Pooling SNPPyrosequencing標準曲線的建立 取3號雜交種（C/G）及其母本（G/G）、父本（C/C）的基因組 DNA（20 ng/μL），按照 C3（3C/C）、C2（2C/C∶1C/G）、C1（1C/C∶2C/G）、Hybrid（3C/G）、G1（1G/G∶2C/G）、G2（2G/G∶1C/G）、G3（3G/G）的梯度比例混合DNA模板，進行PCR擴增和焦磷酸測序，分析等位基因頻率C%，并建立C%與不同梯度的標準曲線。

1.2.5 3 Pooling SNPPyrosequencing分析模型樣品檢驗 選擇SNP位點為C/G分型的黃瓜雜交品種8號進行樣品檢驗試驗。選顆粒飽滿、大小均勻籽粒30粒，浸泡、萌發、每3個種子DNA等量混合，進行PCR擴增、焦磷酸測序以及等位基因頻率分析。根據建立的標準曲線模型，換算出其中來自親本的污染。

1.2.6 數據分析 SNP多態信息量PIC值使用PIC_CALC軟件計算，TTEST和標準曲線制定使用office excel軟件完成。

2 結果與分析

2.1 CLA13（C/G）位點分型及多態信息量分析

對16個黃瓜雜交種及其親本的CLA13（C/G）位點進行PCR擴增及焦磷酸測序分析，分型結果見表2。在16個子代中，7個檢測為C/G雜合，因此CLA13（C/G）位點適合7個品種做黃瓜種子純度鑒定試驗。進一步對CLA13（C/G）位點多態信息量（PIC）分析表明，在16個黃瓜雜交種的群體中該SNP位點PIC達0.556，處于高度多態。

2.2 DNA Pooling最適數量的確定

為提高種子純度檢測效率，研究引入DNA Pooling技術，通過分析DNA Pooling中SNP位點的等位基因頻率，確定樣品的雜合程度，并轉換為種子純度。按一定梯度比例混合C/C基因型和C/G基因型DNA，模擬不同DNA Pooling，并通過比較不同DNA Pooling下等位基因頻率差異顯著性，確定最適DNA Pooling。

表2 16個黃瓜雜交種及其親本CLA13（C/G）位點分型分析

如表3所示，隨著Pooling數量的增加，C%平均值逐漸下降并接近50%。對2～20 Pooling C%值進行TTest分析顯示，4 Pooling以下呈顯著差異水平，3 Pooling以下呈極顯著差異水平。考慮試驗的準確性和可靠性，選擇3 Pooling作為最佳Pooling數量，即在種子純度檢測過程中，將3粒種子作為1個Pooling進行檢測具備較高的效率和準確度。

2.3 3 Pooling SNPPyrosequencing標準曲線的建立

為了把C等位基因頻率轉換為3 Pooling中雜交種的數量，需建立3 Pooling SNPPyrosequencing標準曲線。結果顯示，隨著C3-G3七個梯度樣品中C基因降低和G基因升高，焦磷酸測序峰圖（圖1A）中C堿基峰高從后續堿基T、C、G的1倍峰高逐步降低為0，G堿基峰高從0逐漸升高到與后續堿基T、C、G的峰高持平；建立C%與C3-G3七個梯度樣品標準曲線（圖1B），兩者呈線性關系，R2達0.998 2。參考該標準曲線，可通過畫圖比較或計算的方法將C%轉換出3 Pooling樣品中是否含有或含有幾粒C/C或G/G類型種子。

表3 不同DNA Pooling數量C等位基因頻率分析

圖1 3Pooling下C梯度測序結果及標準曲線

2.4 3 Pooling SNPPyrosequencing分析模型樣品檢驗

如表4所示，10個Pooling中第1 Pooling C%值為65.3%，第7 PoolingC%值為66.2%，說明第1 Pooling和第7 Pooling的3粒種子中含有1個C/C類型的種子，而其他8個Pooling均為C/G類型的種子。因此，該30粒種子中含有2粒非雜交種，純度可記為93.3%。

表4 3Pooling檢驗黃瓜雜交品種種子純度結果

3 討論與結論

種子純度是指雜交種后代表型的一致性，是黃瓜種子質量的重要指標。造成黃瓜種子純度低的主要原因有親本純度不夠高、生物混雜和機械混雜等原因，其中來自母本的混雜較為普遍。因此，雜交種中母本基因型的檢測是分子檢測的重點。SNP分子標記是繼SSR標記以后的第三代分子標記，具有高密度和高度遺傳穩定性等優點，而且大多數只有兩種等位基因型，所以也被稱為雙等位基因標記（biallelic marker），能夠明顯區分出母本、父本及雜交種基因型。因此，SNP分子標記適合于黃瓜品種真實性和純度檢測的要求。

研究將SNP標記技術、Pyrosequencing技術和DNA Pooling技術有機結合，建立3 Pooling SNP Pyrosequencing種子純度檢測分析模型，克服了RAPD、SSR等分子標記技術必須凝膠電泳的瓶頸，提高了黃瓜雜交種純度鑒定效率。同時，3 Pooling SNPPyrosequencing分析模型可應用于其他作物種子純度鑒定，具有推廣價值和應用前景。

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[5] Lin Y S，Liu FG，Wang T Y，et al.A simplemethod using PyrosequencingTM to identify de novo SNPs in pooled DNA samples[J].Nucleic Acids Research，2011，39（5）：28.

[6] 蘭青闊，張桂華，王 永，等.基于InDel標記快速檢測黃瓜津優38 種子純度[J].種子，2011，30（6）：19-23.