嘧肽酶素的高效液相色譜分析方法研究

魏 鳳，楊仁斌，蔣 波，傅 強(qiáng)，蔣詩(shī)琪，盧靜宜

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

嘧肽霉素是由不吸水鏈霉菌（Streptomyces achygroscopicus）產(chǎn)生的一種新型的抗病毒農(nóng)用抗生素，對(duì)番茄病毒病、煙草花葉病毒病、辣椒病毒病、瓜類病毒病和玉米矮花葉病毒病等均有顯著防效[1-2]。目前，對(duì)嘧肽酶素的研究主要集中在生產(chǎn)、抗病機(jī)理及其抗生組份等方面，而對(duì)嘧肽酶素分析檢測(cè)方法的報(bào)道較少。筆者采用高效液相色譜法對(duì)嘧肽酶素進(jìn)行檢測(cè)分析，探討了嘧肽酶素的色譜檢測(cè)條件。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)儀器 LC-20AT型高效液相色譜儀（帶紫外檢測(cè)器及LC solution工作站，日本島津公司）；紫外分光光度計(jì)（島津UV-2450）；玻璃儀器氣流烘干器（KQ-C，鞏義市英峪予華儀器廠）；超聲波清洗器（KQ-100 E，昆山市超聲儀器有限公司）；萬分之一天平（島津AUY 220）；電子天平（上海光正醫(yī)療儀器有限公司）。

1.1.2 主要試劑 99.0%的嘧肽酶素標(biāo)準(zhǔn)品和4.0%的嘧肽酶素試樣（農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所）；甲醇（色譜純）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)液和試樣的配制 標(biāo)液：準(zhǔn)確稱取0.025 0 g嘧肽酶素標(biāo)準(zhǔn)品于50mL棕色容量瓶中，用20%甲醇溶液（甲醇∶水=20∶80，V∶V）溶解并稀釋至刻度。試樣：準(zhǔn)確稱取0.025 0 g嘧肽酶素試樣于50mL棕色容量瓶中，用20%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，用0.45μm濾膜過濾，濾液備用。

1.2.2 色譜條件 Inertsil ODS-SP色譜柱（5μm，4.6 mm×250 mm）；進(jìn)樣量 20 μL。對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相配比、流速及柱溫4個(gè)條件進(jìn)行優(yōu)化：在190～350 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，選擇最適檢測(cè)波長(zhǎng)；流動(dòng)相為甲醇-水溶液，體積比：1∶99、4∶96、7 ∶93、10 ∶90； 流 速 ：1.0 mL/min、0.9 mL/min、0.8 mL/min、0.7mL/min、0.6mL/min）；柱溫：25℃、30℃、35℃。

1.2.3 測(cè) 定 在最適色譜條件下，待儀器基線基本穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)樣溶液，計(jì)算各次響應(yīng)值的重復(fù)性，待相鄰2次的響應(yīng)值變化小于1%，按照標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測(cè)定[3]。

試樣嘧肽酶素質(zhì)量分?jǐn)?shù) X1（%）=A2·m1·P/A1·m2；式中：A1為標(biāo)樣溶液中嘧肽酶素的峰面積平均值，A2為試樣溶液中嘧肽酶素的峰面積平均值，m1為標(biāo)樣的質(zhì)量（g），m2為試樣的質(zhì)量（g），P 為標(biāo)樣中嘧肽酶素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）。

1.2.4 線性關(guān)系檢驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取嘧肽酶素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇-水溶液逐級(jí)稀釋，配置成一系類質(zhì)量濃度為 0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2mg/L 的工作液；在最適色譜條件下，分別進(jìn)行測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度的檢驗(yàn) 在最適色譜條件下，對(duì)同一待測(cè)樣品重復(fù)測(cè)定6次，以檢驗(yàn)分析方法的穩(wěn)定性；準(zhǔn)確稱取5份含有嘧肽酶素的平行試樣，分別加入等量的嘧肽酶素標(biāo)樣，在最適色譜條件下，測(cè)定其添加回收率，以檢驗(yàn)分析方法的準(zhǔn)確度。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

將質(zhì)量濃度為1 mg/L的嘧肽酶素標(biāo)準(zhǔn)溶液在190～350 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描（圖1），結(jié)果表明在250 nm及279 nm處的吸收值相對(duì)較大，但在279 nm處樣品中雜質(zhì)干擾較為強(qiáng)烈，故確定250 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 嘧肽酶素紫外波長(zhǎng)掃描

2.2 流動(dòng)相、柱溫和柱流量的選擇

在高效液相色譜操作條件下，用峰面積進(jìn)行定量，其保留時(shí)間和分離效果進(jìn)行定性[4]，結(jié)果表明：當(dāng)甲醇-水體積比為4∶96，柱溫為30℃，柱流量為0.7 mL/min時(shí)，對(duì)嘧肽酶素的分離效果最好，峰形最好，保留時(shí)間相對(duì)適宜（圖2）。這表明甲醇-水體積比4∶96，柱溫30℃，柱流量0.7 mL/min為最適色譜條件。

2.3 線性關(guān)系

圖2 最適色譜條件下嘧肽酶素的檢測(cè)峰

以工作液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、測(cè)得的相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，得到的線性方程為y=46 618 x+427.84，r=0.999 9，線性關(guān)系良好。

2.4 分析方法的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度

在最適色譜條件下，對(duì)同一待測(cè)樣品進(jìn)行6次重復(fù)測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果分別為4.01%、3.99%、4.00%、4.01%、3.98%、4.00%，其標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0.19，變異系數(shù)為0.20%。這表明該色譜條件下樣品的檢測(cè)較穩(wěn)定，精密度較高。準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果（表1）表明：嘧肽酶素的添加回收率均在97.40%以上，平均添加回收率達(dá)98.81%，這表明該分析方法準(zhǔn)確度較高。

表1 嘧肽酶素的添加回收率

3 結(jié)論

在標(biāo)樣和樣品溶液配置時(shí)，如果采用100%的甲醇進(jìn)行溶解，嘧肽酶素的溶解效果一般，且在嘧肽酶素檢測(cè)時(shí)檢測(cè)峰不對(duì)稱，響應(yīng)值明顯變小，故在配制標(biāo)樣和樣品時(shí)先用少量20%甲醇溶液對(duì)嘧肽酶素進(jìn)行超聲溶解，所得檢測(cè)峰峰形尖銳，對(duì)稱，響應(yīng)值高。

采用高效液相色譜法測(cè)定嘧肽酶素，操作簡(jiǎn)便、快速，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確度高，這表明高效液相色譜法適用于嘧肽酶素的檢測(cè)分析。

[1] 王艷紅，吳元華，朱春玉，等.嘧肽霉素又一抗病毒活性成分的研究[J].沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，37（1）：44-47.

[2] 穆凌霄，伏 穎，趙秀香，等.嘧肽霉素一種新的生物活性組分分離純化研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50（18）：3728-3731.

[3] 柳王榮，楊仁斌，黃堯，等.甲維鹽在水稻環(huán)境中的殘留分析方法[J].農(nóng)藥，2011，50（5）：362-364.

[4] 鄭立國(guó)，楊仁斌.虱螨脲在土壤生態(tài)系統(tǒng)中的檢測(cè)方法及持久性研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2009，28（11）：2407-2411.