殼寡糖種衣劑的制備及其對玉米防御酶系的影響

馬 鏑，金 星，趙新華，李春紅，曹敏建

（沈陽農業大學，遼寧 沈陽 110866）

玉米絲黑穗病是絲軸黑粉菌引起的世界性重要病害，在中國北方春玉米產區發生較為嚴重[1]。殼寡糖是植物識別病源真菌入侵的非特異性信號，對許多植物顯示強烈的誘導活性可激發植物的自身抗性[2]。當玉米受到微生物侵染時，會啟動自我防御響應以抵抗病原菌進攻，這種自我防御能力可以由外源性寡糖誘導產生，激活玉米防御酶系活性，提高自身抵抗力。

早期對玉米絲黑穗病的研究主要集中在生物學特性、發生條件、防治方法等方面[3]。近期出現了對玉米絲黑穗病抗性機制的研究，如對根系滲出物、Vc和總糖含量與病菌互作的研究，還有對玉米絲黑穗病菌侵染后的寄主防御酶系活性變化的研究[4]，但對于殼寡糖誘導抗性的研究未見報道。試驗研究了殼寡糖種衣劑和化學種衣劑處理的玉米在接種和不接種玉米絲黑穗病菌的狀態下，其防御酶系活性的變化。以期為生產上減少化學農藥使用量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 玉米品種為先玉335。

1.1.2 土 樣 采自長白山土壤，共收集25份樣品，采集后自然晾干后置于4℃冰箱保存。

1.1.3 培養基 富集培養基：殼聚糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏2 g/L，用土壤浸出液配制。

平板分離培養基：殼聚糖5.0 g/L，KH2PO42.2 g/L，Na2HPO4·12H2O 1.0 g/L，（NH4）2SO40.8 g/L，NaNO31.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CaCl20.01 g/L，KCl 1.5 g/L，蛋白胨 0.5 g/L，酵母膏 0.5 g/L，瓊脂15 g/L，pH值6.0，殼聚糖溶液應事先調至pH值6.0，并與其他成分分開滅菌后混和。

斜面培養基：蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，pH值自然。

種子培養基：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KCl 1.5 g/L，KH2PO41.9 g/L，Na2HPO4·12H2O 0.9 g/L，Na2SO41.5 g/L，CaCl20.01 g/L，調至pH值6.5。

復篩搖瓶培養基：平板分離培養基中不加瓊脂，另外加入葡萄糖5 g/L，其他相同。

1.2 儀器

日本島津紫外-可見分光光度計（UV-12002）；H1TACHI低溫離心機（CR21G）。

1.3 土壤產殼聚糖酶菌株的篩選

1.3.1 富集培養 取各個土樣各約9 g，置于加有100 mL無菌水和玻璃珠的三角瓶中，30℃振蕩（180 r/min）30 min，使樣品充分打散后，放置沉淀，取上清液5 mL，加入到事先滅過菌的富集培養基中，28℃搖瓶富集培養3 d。

1.3.2 菌株分離 以殼聚糖為唯一碳源，用稀釋平板法分離富集后的樣品。于30℃培養箱中培養4～5 d，然后選擇在培養基上形成的透明圈直徑與菌落直徑的比值較大的菌落進一步進行復篩。

1.3.3 菌種純化 將菌株分離后得到的斜面培養基內的菌株接入種子培養基中30℃振蕩（120 r/min）培養2 d后，用接種環取少量菌株樣品接入平板固體培養基，采用平皿劃線分離法對菌株進行純化，于30℃培養2～6 d后得到的單菌落接入斜面培養基。

1.3.4 透明圈法篩選 將菌種純化得到的斜面培養基內純化好的菌株用滅菌后的牙簽點接種于平板分離培養基上，于30℃培養2～3 d，將菌落周圍透明圈稍大者挑出，接入斜面培養基。于30℃培養2～3 d，觀察產生的透明圈。

1.3.5 復篩搖瓶培養法篩選 將透明圈法篩選得到的斜面培養基內菌株接入種子培養基中，30℃振蕩（120 r/min）培養2 d后，取8%接種量接入菌種篩選搖瓶培養基，30℃振蕩（120 r/min）培養，不同時間檢測酶活力。

1.4 殼寡糖的制備

取30.0mL 1.0%的膠體殼聚糖，加入30.0mL pH值5.0乙酸緩沖液稀釋的30.0 mL巨大芽孢桿菌BS-506發酵酶液，55℃反應2 h后，沸水浴10 min終止反應，加入0.25mol/L NaOH 10.0mL，使未完全反應的殼聚糖沉淀，離心，去除沉淀，上清液經冷凍干燥制成粉末，配成2%的殼寡糖溶液。

1.5 試驗設計

試驗共設4個處理：處理1為15%立克秀，處理2為30%頂苗新，處理3為2%殼寡糖，處理4為空白對照（CK）。各處理均分為接種和不接種玉米絲黑穗病菌兩種方式，3次重復，總計24個小區。每個小區播兩行，每埯2粒，株距0.25 m，行距0.6 m，行長6 m，每小區面積為7.2 m2，試驗區總面積為172.8m2。

1.6 種植方法

將每種藥液按定量慢慢沿燒杯壁加入大燒杯內，并將稱取的50倍藥液重量的種子加入燒杯，用手握住燒杯順時針方向甩轉，直至藥液與種子充分混合均勻，杯壁內側干凈無藥為止，使藥液均勻地附著在種子表面，拌好的種子晾干。

2011年5月12日播種，采用壟上埯播，播種時，按0.1%加入絲黑穗病菌粉與菌土充分混勻，開穴后先放種子，然后每埯蓋菌土100 g。

1.7 粗酶液的提取

分別取8種處理的玉米品種先玉335第3葉，去葉脈后，各稱取1 g，－20℃冰箱保存，待測。同時，配置0.2mol/L pH值8.8的硼酸緩沖液500mL。取出冰箱中的樣品，放入預冷的研缽中，加入1.5 mL硼酸緩沖液，冰浴中充分研磨后，轉移至預冷的離心管，用1.5mL上述緩沖液沖洗，合并倒入預冷的5mL 離心管中，10 000 r/min，4℃離心 20min，上清液即為酶粗提取液。將酶粗提取液迅速倒出，放入－20℃冰箱中保存待用。

1.8 玉米防御酶系活性測定

過氧化物酶（POD）活性測定參照李合生等[5]方法。超氧化物歧化酶（SOD）活性測定參照Giannoplitis和Ries[6]及劉鴻先等[7]的方法。多酚氧化酶（PPO）活性測定參照李靖[8]方法。苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性測定參照Koukol和Cornn[9]方法。

2 結果與分析

2.1 產殼聚糖酶菌株篩選結果

在富集培養基中，以殼聚糖為唯一碳源，通過對各個土樣的富集培養，能利用殼聚糖的微生物大大增加，而不能利用的則大部分被淘汰。采用透明圈法，在以殼聚糖為唯一碳源的平板上篩選分離得到了9株產殼聚糖酶菌株。經菌落觀察和鏡檢，大部分為霉菌，少數是細菌和酵母菌。在培養過程中，挑選菌落生長良好，透明圈明顯的菌落繼續培養，產生的透明圈不斷增大。

圖1 SH-0109菌株產生的透明圈

選擇透明圈直徑和菌落直徑比值（D/d）較大的9個菌落為出發菌株，進一步進行搖瓶發酵，48 h后測定發酵液的殼聚糖酶酶活，結果表明SH-0109為產殼聚糖酶最好的菌株，菌落直徑為4.0mm，透明圈直徑30.0mm，透明圈直徑與菌落直徑的比值為7.5，酶活力為0.55 U/mL。

2.2 種衣劑對玉米葉片POD活性的影響

過氧化物酶（POD）在植物機體防御體系中起重要作用，不僅參與了木質素的聚合過程，也是細胞內重要的內源活性氧清除劑，結果表明（圖2），無論在接種區還是非接種區，殼寡糖種衣劑都能提高POD酶活性。使用殼寡糖，POD酶活在接種區達28.02 U/mg，非接種區達27.57 U/mg，均比對照的POD酶活高。殼寡糖種衣劑可提高POD的活性。因此，可以通過殼寡糖部分取代化學農藥，提高植物體過氧化物酶的活性。

圖2 種衣劑對玉米POD活性影響

2.3 種衣劑對玉米葉片SOD活性的影響

SOD是一種活性氧清除酶類，是植物細胞內防御酶系統的重要成員之一。使用殼寡糖種衣劑，SOD酶活在接種區達156.72 U/mg，非接種區達150.19 U/mg，均比對照（處理4）的SOD酶活高。試驗結果表明（圖3），無論在接種區還是非接種區，均表現為殼寡糖種衣劑對SOD酶活提高幅度更大。因此，可以通過殼寡糖部分取代化學農藥，提高植物體自身的防御酶活。

圖3 種衣劑對玉米SOD活性影響

2.4 種衣劑對玉米葉片PPO活性的影響

PPO是一種抗病反應次生代謝酶類，主要參與酚類氧化為醌以及木質素前體的聚合作用，與植物抗病密切相關。結果表明（圖4），無論在接種區還是非接種區，均表現為殼寡糖種衣劑對PPO酶活提高幅度更大。使用殼寡糖種衣劑，PPO酶活在接種區達456.72 U/mg，非接種區達440.19 U/mg，均比對照的PPO酶活高。殼寡糖種衣劑可提高PPO的活性。因此，可以通過殼寡糖部分取代化學農藥，提高植物體自身的防御酶活，減低化學農藥對環境的污染。

圖4 種衣劑對玉米PPO活性影響

2.5 種衣劑對玉米葉片PAL活性的影響

PAL是植物苯丙烷類次生代謝途徑總路第一步關鍵酶，是苯丙烷類代謝途徑的關鍵酶和限速酶，它催化苯丙氨酸脫氨基后產生肉桂酸并最終轉化為木質素，因此它是與細胞內木質素生成和沉積有關的防御酶。使用殼寡糖種衣劑，PAL酶活在接種區達308.72 U/mg，非接種區達303.19 U/mg，均比對照（處理4）的PAL酶活高。殼寡糖種衣劑可提高PAL的活性。結果表明（圖5），在接種區和非接種區均表現為殼寡糖種衣劑對PAL酶活提高幅度更大。

圖5 種衣劑對玉米PAL活性影響

3 結論與討論

植物的抗病性一般包括植物細胞內活性氧的積累與清除、抗病信號的產生與轉導、防衛反應的表達與調控等。在這一復雜過程中，一些酶類起著很重要的調控作用，相關酶類包括活性氧清除酶類和抗病反應次生代謝酶類。宋瑞芳等[10]研究認為POD是催化脂肪族、芳香族和酚類化合物氧化及木質素合成的關鍵酶之一。PAL是植物抗性物質生成途徑莽草酸途徑中酚類物質、植保素、木質素等抗菌物質合成過程中最關鍵的酶類。PAL是誘導酶，是植物抗病代謝（莽草酸途徑）的關鍵酶和定速酶，POD不僅參與木質素的聚合反應，而且是細胞內重要的內源活性氧清除劑，PPO是酚類物質氧化的主要酶，酚類物質氧化產生醌類或參與木質素的合成，以殺死或抑制病原菌的繁殖而起到抗病作用，SOD能消除超氧自由基而對細胞具有保護作用。

殼寡糖種衣劑作為生物農藥在玉米上的報道較少，關于其誘導玉米自身抗性的研究還未見報道。該研究為進一步探討其誘導抗性機制提供了依據。研究結果表明，經由立克秀或定苗新處理后4種酶活性均較對照稍低，表明化學農藥對玉米的防御酶系活力有一定傷害；而殼寡糖處理玉米種子之后，植株的防御酶系（PAL、POD、PPO、SOD）活性普遍升高，表明殼寡糖能夠誘導植物的信號系統，啟動植株體內防御酶系的表達。殼寡糖通過調整植物抗病基因的活化，使玉米產生對玉米絲黑穗病的抗性，并非直接作用于病原菌的抑菌反應。因此，在病原菌侵入前進行殼寡糖種子處理，才能達到防病的效果。

[1] 張小飛，高增貴，莊敬華，等.玉米絲黑穗病菌致病性分化研究[J].玉米科學，2010，18（2）：100-103.

[2] 趙龍杰，徐翠蓮，韓富根，等.殼寡糖席夫堿對煙草花葉病毒的誘導抗性[J].江蘇農業科學，2011，39（5）：131-133.

[3] 時俊光，王作英，陳曉旭.幾種玉米種衣劑對玉米絲黑穗防治效果篩選試驗研究[J].雜糧作物，2010，30（2）：136-137.

[4] 賀字典，高增貴，莊敬華，等.玉米絲黑穗病菌對寄主防御相關酶活性的影響[J].玉米科學，2006，14（2）：150-151，155.

[5] 李合生.植物生理生化實驗原理和技術[M].北京：高等教育出版社，2000.164-165.

[6] Giannoplitis C N,Ries S K.Superoxide dismutase:I.Occurrence in higher plants[J].Plant Physiol,1997,59:309-314.

[7] 劉鴻先，曾韶西，王以柔.低溫對不同耐寒力的黃瓜子葉各細胞器中超氧物歧化酶的影響[J].植物生理學報，1985，（11）：46-57.

[8] 李 靖，利容千，袁文凈.黃瓜感染霜霉病菌葉片中一些酶活性的變化[J].植物病理學報，1991，12（4）：227-283.

[9] Koukol J,Cornn E E.Themetabolism of aromatic compounds in higher plants IV. Purification and propcities of the phenylalanine-deaminase of Herdeum vulagare[J].Journal of Biological Chemistry,l961,23:2692-2698.

[10] 宋瑞芳，丁永樂.煙草抗病性與防御酶活性間的關系研究進展[J].中國農學通報，2007，23（5）：309-314.