碎米薺CarKCS基因全長CDS克隆、序列分析及表達載體構建

楊 慧，魏解冰，阮 穎，劉春林*

(1作物種質資源創新與利用國家重點實驗室培育基地，長沙410128;2湖南農業大學農學院;3湖南農業大學生物科學與技術學院，長沙410128)

神經酸，化學名為順－15－二十四碳烯酸(24:1)，是一種超長鏈單不飽和脂肪酸(VLCMFA)，存在于蒜頭果、碎米薺、銀扇草、大麻、雞爪槭、旱金蓮、遏藍菜、盾葉木、元寶楓等植物的種子油中［1，2］。有研究表明，神經酸是大腦神經細胞和神經組織的核心天然成分，是迄今為止世界上發現的能促進受損神經組織修復和再生的特效物質，是神經細胞特別是大腦細胞、視神經細胞、周圍神經細胞生長、再發育和維持的“必需高級營養素”，對提高腦神經的活躍程度，防止腦神經衰老有很大作用［3］。但人體自身很難生成神經酸，只能靠體外攝取來補充。目前人們正致力于生產天然的神經酸油用于醫藥、營養制品和工業應用。自然界中含神經酸植物的果實含油量、神經酸含量差異較大，開發成本高，要開發神經酸產品，需要低成本地獲得天然高含神經酸的資源。

神經酸的合成過程主要涉及到β－酮脂酰－CoA合酶(3－ketoacyl－CoA synthase，KCS)、β－酮脂酰－CoA還原酶 (3－ketoacyl－CoA reductase，KCR)、β－羥脂酰－CoA脫水酶(3－hydroxacyl－CoA dehydratase，HCD)和反式烯脂酰－CoA還原酶(trans－2，3－enoyl－CoA reductase，ECR)，這4種酶協同作用形成功能復合體，稱為脂肪酸延長酶［4］。其中β－酮脂酰－CoA合酶又稱為脂肪酸延長酶1(Fae1)或簡稱KCS。有研究顯示，雖然所有植物及微生物體的脂肪酸延長酶系統中都普遍存在著這4種酶，但除第一個酶β－酮脂酰－CoA合酶(KCS)起著關鍵作用外，其它3種酶的作用處于次要地位，因此KCS酶的活性高低成為制約超長鏈脂肪酸合成的重要因素［5］，是超長鏈脂肪酸合成反應的限速酶［6］。目前許多低芥酸油菜品種的育種原理都是通過該酶的突變完成的。Millar和Kunst在酵母中成功地利用強半乳糖誘導型啟動子表達了擬南芥的fae1基因，并且在轉化株中積累了20:1，22:1以及24:1這些在非轉化酵母培養物中不存在的脂肪酸［7］。Fae1基因是β－酮脂酰－CoA合酶的編碼基因，也是控制芥酸等超長鏈脂肪酸合成的關鍵基因［8］。Elzbieta Mietkiewska等人克隆了銀扇草的KCS基因，將其轉入野生型擬南芥中，種子油脂肪酸成分分析表明神經酸的含量增長了30倍，轉入埃塞俄比亞芥也使其種子油中神經酸含量增長了7至10 倍［9］。GenBank 中 尚 無 碎 米 薺 (Cardamine hirsuta L.)KCS基因cDNA序列的記錄。本實驗根據KCS基因的保守性，設計引物，通過PCR克隆神經酸含量較高的碎米薺的KCS基因，并將其連接到種子特異性啟動子NapinA上，構建成過表達載體，用來轉化高芥酸含量的甘藍型油菜，希望通過生產油菜來獲得神經酸產品。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試品種

碎米薺，采于湖南農業大學校內路旁;高芥酸含量的甘藍型油菜品種GX－29，為湖南農業大學植物代謝調控研究組提供。

1.1.2 菌株

DH5α，LBA4404，為湖南農業大學植物代謝調控研究組保存。

1.1.3 載體與質粒

pMD19－T載體購自 TaKaRa公司。pFGC－5941.nap［10］表達載體為本實驗室以NapinA啟動子置換pFGC－5941質粒35S啟動子改造而成。

1.1.4 分子生物學試劑

TaqTMDNA聚合酶購自東盛生物;LongAmp TaqDNA Polymerase購自BioLabs公司;限制性內切酶，DNA T4 Ligation Kit購自晶美公司;質粒DNA小量純化 Kit，DNA凝膠回收 kit購自安比奧公司;DNA Marker購自北京天根;CTAB，Tris base，EDTA均購自歐邁生物;瓊脂糖:西班牙產;酵母提取物、蛋白胨購自OXOID.L TD;抗生素購自北京鼎國生物技術發展中心。

1.2 方法

1.2.1 碎米薺總DNA的制備

以碎米薺幼葉為材料，參照CTAB法制備［11］。

1.2.2 引物設計及目的基因的全長CDS克隆

登陸 NCBI網站 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，未找到碎米薺KCS基因的相關信息，但找到碎米薺屬Cardamine graeca L.的KCS基因mRNA全長序列(EU871788)。下載后利用DNAS TAR軟件進行序列編輯和分析，該KCS基因全序列，不含內含子，總長度為1 521 bp，共編碼506個氨基酸。而KCS基因在不同的種間都具有很大的保守性，因此可以根據該序列用Primer Premier 5.0軟件設計引物擴增碎米薺的KCS基因全序列。并根據質粒載體pFGC5941.nap的限制性酶切位點，在正反向引物的5'端分別加入AscI和BamHI位點。引物由南京金斯瑞(Genscript)生物科技有限公司合成。引物序列如下:

KCSSF:5'－GGCGCGCCATGACGTCCATTAACG TAAAGCTC－3'

KCSSR:5'－GGATCCTTAGGACCGACCGTTT TGGGCA－3'

高保真LongAmp TaqDNA聚合酶PCR擴增的反應體系為50 μL，反應條件:94℃預變性3 min;94℃變性30 s;70℃退火10 s;72℃延伸80 s;72℃延伸7 min;16℃保存。擴增28個循環。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后用安比奧公司DNA凝膠回收kit進行回收純化后，連接到載體 pMD19－T構建成T載體，命名為T－CarKCS。熱激法將此連接質粒轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中，取100 μL涂到LB固體培養基(含氨芐青霉素50 μg/mL)上，于37℃過夜培養，重組子經鑒定后送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

1.2.3 序列的生物信息學分析

可在NCBI站點上進行氨基酸序列推導及結構域分析，通過 EXPASY的 ProtParam(http://us.expasy.org/tools/protparam.html)分析 CarKCS基因編碼蛋白的理化性質，應用SMART(http://smart.embl－heidelberg.de/)在線預測CarKCS基因編碼蛋白的結構域，用Clustal W軟件進行氨基酸序列同源性比對，再用MEGA 4.1做系統進化樹分析。

1.2.4 種子特異表達載體的構建

用限制性內切酶AscI和 BamHI分別對 TCarKCS載體和pFGC－5941.nap質粒進行雙酶切。酶切得到的目的片段和載體均用凝膠回收kit回收，再按3∶1的連接體系進行連接。將切下的TCarKCS片段插入pFGC－5941.nap質粒的相應位點，構建成pNapin－CarKCS載體。將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，再涂布于 LB平板(含卡那霉素50 μg/mL)上篩選陽性克隆，通過菌落PCR檢測陽性克隆。按常規方法提取質粒，進行PCR反應及酶切驗證獲得帶有目的基因的植物過表達載體。

2 結果與分析

2.1 目的片段的克隆和測序

根據合成引物的退火溫度，設計溫度梯度PCR，確定最佳的退火溫度為53℃，然后以53℃為退火溫度做PCR擴增，擴增結果如圖1。從電泳圖可以發現擴增條帶大小約為1 500 bp，擴增片段的大小與預期的一致。回收PCR產物，連接到pMD19－T載體上，用熱激法轉化大腸桿菌DH5α的感受態細胞，取100 μL涂布到含50 μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養基上，于37℃過夜培養，挑單菌落做菌落PCR，如圖2所示。圖中4、5、7號泳道都為陽性克隆，選取7號泳道的陽性克隆送公司測序。測序結果表明，去掉載體及酶切位點后擴增產物的大小為1 518 bp。將測序結果在NCBI上進行Blast同源分析比對，此序列與碎米薺屬Cardamine graeca L.的KCS基因的mRNA全長序列(EU871788)同源性達到88%。由此表明，所克隆的片段為CarKCS基因的全長序列。

圖1 CarKCS目標片段的PCR產物Fig.1 PCR test of CarKCS fragment

圖2 菌落PCR檢測結果Fig.2 Results of PCR test of colonies

2.2 序列及蛋白質的理化性質分析

將測序的CarKCS基因CDS序列在NCBI上進行翻譯，發現該基因編碼505個氨基酸，不含內含子，全長為1 518 bp的完整開放閱讀框，相對分子質量為 56 346.0，等電點為 9.41。而碎米薺屬Cardamine graeca L.的KCS基因(EU871788)編碼506個氨基酸，相對分子質量為56 465.1，等電點為9.25。進一步將在NCBI上翻譯得到的氨基酸序列用SMART在線進行蛋白質結構預測及分析，結果表明，其在第9至第31位氨基酸、第51至第70位氨基酸及第342至第364位氨基酸分別構成了3個跨膜結構域。

許多科學家都對甘藍型油菜中KCS活性喪失的原因進行了大量研究。Han等發現，在所有有功能的KCS蛋白中第282位氨基酸都為絲氨酸殘基，而無功能的蛋白在該位都為苯丙氨酸殘基［12］，CarKCS基因在第282位氨基酸都為絲氨酸殘基。Ghanevati等利用酵母表達系統，進行定點突變研究，還證實了 Cys223，His302，His387，His391 和His420都是組成β－酮酯酰－CoA合酶的活性位點的氨基酸殘基，這些氨基酸任何一個發生突變都會導致酶活性的喪失［13，14］。

將CarKCS基因氨基酸序列與擬南芥中同源性最高的KCS18氨基酸序列進行ClustalW分析，再用MEGA做系統進化樹圖譜如圖3，結果表明該基因有 Ser282，Cys223，His302，His387，His391 和 His420這些活性位點的氨基酸都存在，據此可以推測該基因具有正常的催化功能。

圖3 CarKCS與KCS18酶活性位點分析圖Fig.3 Analysis on enzyme active site between CarKCS and KCS18

2.3 CarKCS基因的系統進化樹分析

KCS基因家族主要存在于植物界，擬南芥脂基因數據庫中揭示了21個KCS相關基因的存在［15］。Lessire等人根據氨基酸序列同源性進行ClustalW比對，可將其劃分為4個亞組:FAE1－like，KCS1－like，FDH － like，CER6 － like［16］。這些 KCS 基因存在組織、器官的特異性表達和底物特異性。它們對飽和的及單不飽和的C16和C18脂肪酰－CoA具有較高的活性，其中7個基因(FAE1，KCS1，KCS2，At5g43760，Atlg04220，CER60，At2g16280)在酵母中異源表達后可催化VLCEAs合成，不同程度的積累C20 ～C30 脂肪酸［17，18］。碎米薺與擬南芥同屬于十字花科植物，本實驗通過Clustal W將CarKCS與擬南芥KCS基因家族成員的氨基酸序列進行同源性比對分析，發現CarKCS基因與KCS18的親緣關系最近，同屬于FAE1－like亞家族。

圖4 CarKCS與擬南芥KCS基因家族蛋白的進化樹Fig.4 A phylogenetic tree of family proteins of CarKCS and KCS gene

2.4 CarKCS基因種子特異表達載體的構建

用AscI和BamHI分別雙酶切T－CarKCS和pFGC－5941.nap質粒，切膠回收目的片段，并用T4連接酶將T－CarKCS片段和pFGC－5941.nap載體目的片段連接，根據pFGC－5941.nap載體序列和目的片段序列設計一對引物用來檢測載體是否插入目的片段，引物序列如下:

NAP－F:5'－GCTTCTCTCTCACAGCACACA CATAC－3'

KCS－R:5'－ TGAACATGCAACAAGTCTTTAG CCAGATC－3'

從圖5中分析，2號和3號泳道均以pNapin－CarKCS質粒為模板，2號泳道為檢測引物所擴增出的條帶，大小為848 bp左右，與所設計的大小相符。3號泳道為KCS基因引物所擴增出的條帶，大小為1.5 kb左右。說明CarKCS片段已成功插入pFGC－5941.nap表達載體中，已成功構建好pNapin－CarKCS過表達載體。

圖5 pNapin－CarKCS過表達載體的PCR檢測Fig.5 PCR detection of pNapin－CarKCS overexpression vector

2.5 種子特有表達載體的酶切驗證

用AscI和 BamHI雙酶切所提的 pNapin－CarKCS質粒，如圖6所示。泳道 2為 pNapin－CarKCS質粒雙酶切后得到的片段長度與目的片段的大小剛好相符，證明目的基因碎米薺β－酮脂酰－CoA合酶(KCS)基因已成功連接到 pFGC5941.nap質粒為載體的植物表達載體中。進一步驗證了CarKCS片段已成功插入pFGC－5941.nap表達載體中，已成功構建好 pNapin－CarKCS過表達載體。

圖6 pNapin－CarKCS過表達載體的酶切檢測Fig.6 Enzyme detection of overexpression vector of pNapin－CarKCS

3 討論

擬南芥是一種良好的十字花科模式植物。Rosska等以擬南芥為材料，分別對40粒開花后3～15 d的未成熟種子和第17 d的成熟種子進行了脂肪酸成分分析，結果發現超長鏈脂肪酸從第7 d才開始出現，然后迅速積累直至第13 d，到第15 d種子接近成熟時超長鏈脂肪酸的合成也隨之基本完成［19］。Tumham和Northocet通過實驗發現甘藍型油菜中儲存脂也在胚發育中期合成速率最大［20］。本實驗構建的pNapin－CarKCS過表達載體啟動子來源于甘藍型油菜種子儲藏蛋白Napin A基因的啟動子，具有種子特異、高效表達的特性，能夠滿足超長鏈脂肪酸合成的限速酶基因(KCS基因)在油菜種子中特異表達與調控。

圖7 CarKCS基因過表達載體構建示意圖Fig.7 Construction of the overexpression vector of CarKCS gene

芥酸是形成神經酸的原料，通過KCS的延長催化作用，加入2個碳原子后就能合成24:1的神經酸。以往通過基因工程的方法獲得能產生神經酸的轉基因植株，基本上是將克隆的KCS轉到擬南芥或其它植物中，如埃塞俄比亞芥。但這些植物往往不是大田作物，且芥酸(22:1)含量極低。油菜作為主要的油料作物之一，廣泛種植于中國、加拿大、澳大利亞及北歐國家，已成為第三大經濟作物，菜子油已經成為第三大植物油［21］;而且在油菜的一些材料中芥酸含量很高。所以，在成功構建了碎米薺CarKCS基因的種子特異表達載體基礎之上，我們將進一步通過農桿菌介導的轉化法轉化高芥酸含量的甘藍型油菜品種GX－29，以期獲得pNapin－CarKCS表達的穩定轉基因植株，篩選出神經酸含量高、產量高的穩定轉基因油菜植株，以為獲得廉價的神經酸產品來滿足社會需求奠定基礎。

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