油菜籽油酸合成相關(guān)基因研究進(jìn)展

張浩文，唐志東，譚勇俊，劉忠松

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128)

提高油酸含量是油菜品質(zhì)育種的重要目標(biāo)［1］。脂肪酸合成途徑目前已有較深入的研究［2，3］，植物種子中脂肪酸合成途徑如圖1。在植物種子中油酸是脂肪酸合成途徑中的一個(gè)中間產(chǎn)物，其合成不僅涉及到脂肪酸生物合成途徑中一系列的酶促反應(yīng)，還與ACP(酰基載體蛋白)的縮合反應(yīng)和ACP硫酯酶、ACS(酰基輔酶A合成酶)有關(guān)。種子中脂肪酸合成有關(guān)的主要場(chǎng)所有兩個(gè):質(zhì)體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。

在質(zhì)體中，乙酰輔酶A經(jīng)過了一系列的羧化和縮合生成16:0ACP。該物質(zhì)在β－酮酯酰－ACP合成酶Ⅱ(KASⅡ)作用下生成18:0ACP。18:0ACP在硬脂酸脫氫酶(FAB2)作用下生成18:1Δ9 ACP。18:0ACP、18:1Δ9 ACP在更傾向不飽和 ACP的ACP硫酯酶A(FAT A)作用下水解成游離脂肪酸并通過ACS轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的COA運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中;16:0ACP在更傾向于飽和ACP的ACP硫酯酶B(FAT B)作用下水解成游離脂肪酸并通過ACS轉(zhuǎn)化成16:0 COA運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中18:0COA可以一直延伸為24:0 COA;18:1ACP通過甘油二酯途徑生成油酰磷脂(18:1Δ9 ACP)，此物質(zhì)為生成油酸的前體。有兩個(gè)酶促反應(yīng)都以此物質(zhì)為底物，其中由脂肪酸延長(zhǎng)酶(FAE)控制生成芥酸的反應(yīng)更具競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，在雙低油菜中該反應(yīng)被截?cái)?另一個(gè)反應(yīng)是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)油酸脫氫酶(FAD2)控制下生成亞油酸，該反應(yīng)是影響雙低油菜油酸含量的最主要反應(yīng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的COA和PC都能進(jìn)入TAG(三酰甘油)途徑生成油脂。

從脂肪酸合成途徑看，影響種子中油酸合成的基因較多。在質(zhì)體中主要有 KASⅡ，F(xiàn)AB2，F(xiàn)AT，ACS;影響油酸積累的是FAD2和FAE1基因。

圖1 油菜種子內(nèi)油酸合成示意圖(改編自楊燕宇［4］)

1 與油酸合成有關(guān)的基因

KASⅡ是編碼16:0 ACP到18:0 ACP的酰基蛋白合成基因，在擬南芥葉肉細(xì)胞中69%的16:0ACP轉(zhuǎn)化由KASⅡ控制［5］。在油菜中很早就有有關(guān)分離和克隆KAS基因家族CDNA的報(bào)道［6］。在E.coli中KAS酶的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)測(cè)定［7］，油菜中只確定了KASⅢ和 KASⅠ酶的晶體結(jié)構(gòu)［8］。擬南芥中，用基因干擾降低KASⅡ的表達(dá)水平，能使硬脂酸比例提高，油酸比例減少，通過RNA干擾KASⅡ，16:ACP的濃度是野生型的 7倍［9］。萼距花 (Cuphea wrightii)的KASⅡcDNA在擬南芥中表達(dá)，主要是增加了短碳鏈ACP(C10:0和C12:0)的量，而中碳鏈 ACP(C14:0 和 C16:0)的量減少［10］。KASⅡ原核表達(dá)的結(jié)果不盡相同，在棕櫚(Jessenia bataua)中獲得的KASⅡcDNA，通過融合蛋白的形式在擬南芥中表達(dá)，提高了花生烯酸和芥酸的含量，而且KASⅡ基因不能完成棕櫚酸到硬脂酸的生化過程，所以棕櫚的KASⅡ基因可能是脂肪酸延長(zhǎng)途徑的一個(gè)候選基因。于此相反，Jha［11］利用在芥菜型油菜中表達(dá)巴西固氮螺菌的酰基載體蛋白(KASⅡ)，提高了種子中油酸的含量，并提高了油酸、亞油酸和亞麻酸之間的比值，降低了芥酸含量。通過蛋白定位發(fā)現(xiàn)棕櫚的KASⅡ作用位置可能在微粒體(推測(cè)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng))，而不同于以往的質(zhì)體，可能是造成此差異的原因。Hakozaki［12］在擬南芥中利用T－DNA插入突變產(chǎn)生的AtKAS2(KASⅡ)基因突變體，RTPCR結(jié)果表明AtKAS2基因在許多器官中表達(dá)，在角果中有高表達(dá)，而GUS實(shí)驗(yàn)表明，該基因的啟動(dòng)子在大量器官中都表達(dá);基因型和表現(xiàn)型的結(jié)果表明該基因在胚胎發(fā)育中是個(gè)必須基因，缺陷體純合子將在小球期到心型期死亡。

FAB2是編碼18:0 ACP至18:1Δ9 ACP的 Δ9脫氫酶的脫氫酶基因。在大豆中，通過抑制FAB2基因，可以增加硬脂酸的脂肪酸含量，而且FAB2基因也有一定的時(shí)空特異性［13］。Kachroo［14］對(duì) FAB2的突變體做了研究，發(fā)現(xiàn)在擬南芥中還存在4個(gè)FAB2的等位基因，但這些基因在種子中的特異性表達(dá)不如FAB2，在突變體無法完全代償FAB2缺陷突變體功能，突變體油酸含量偏低;通過這4個(gè)等位基因的研究，證明油酸的水平是在轉(zhuǎn)錄和翻譯后水平調(diào)控的。

FAT是ACP轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的游離脂肪酸重要水解酶，F(xiàn)AT B主要負(fù)責(zé)水解飽和ACP，F(xiàn)AT A主要負(fù)責(zé)水解不飽和ACP。Li［15］通過連鎖和關(guān)聯(lián)分析相結(jié)合的方法，在玉米中解析了一個(gè)C16:0的QTL(數(shù)量性狀基因座)，在QTL區(qū)域得到了一個(gè)候選基因fatb，該基因編碼ACP硫酯酶。該研究還發(fā)現(xiàn)通過該基因最后一個(gè)外顯子區(qū)域11 bp堿基的插入能降低脂肪酸中C16:0的含量，達(dá)到飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的最優(yōu)比例。Moreno － Pérez［16］發(fā)現(xiàn)擬南芥FAT A基因敲除的突變體的成熟種子油酸含量比正常體要低，干種子中三酰甘油的量有所降低。

ACS是編碼在內(nèi)質(zhì)體內(nèi)膜將游離脂肪酸轉(zhuǎn)化為酰基COA的基因。de Azevedo Souza［17］發(fā)現(xiàn)擬南芥中一個(gè)新的ACS合成基因，該基因突變體沒有花粉且自交不結(jié)實(shí)，推測(cè)該基因影響花粉小孢子的形成。通過反射性基因芯片檢測(cè)，該基因編碼合成的酰基蛋白復(fù)合體在體外的活性，發(fā)現(xiàn)該蛋白的活性與油酸基質(zhì)密切相關(guān)。

FAD3是編碼亞油酸向亞麻酸轉(zhuǎn)化的基因。FAD3能控制亞油酸向亞麻酸轉(zhuǎn)化，低亞麻酸性狀可以整合到高油酸油菜中，但不可以增加油酸含量［18］。

綜上所述，上面的基因與脂肪酸的組成有一定的關(guān)系。其中，KASⅡ，F(xiàn)AB2，F(xiàn)AT與油酸的含量關(guān)系較為密切。抑制FAD3可以達(dá)到降低亞麻酸含量的目的，可以在高油酸育種中進(jìn)行遺傳整合。而現(xiàn)階段為了提高油酸含量應(yīng)主要從FAD2和FAE兩個(gè)基因著手。

2 影響油酸積累的基因

2.1 FAD2基因

轉(zhuǎn)基因研究證明，通過抑制FAD2基因表達(dá)，能顯著提高種子內(nèi)油酸含量。Bao等［19］通過RNAi干擾FAD2基因獲得了6株轉(zhuǎn)基因油菜，在轉(zhuǎn)基因油菜的第三代RT－PCR檢測(cè)FAD2基因表達(dá)顯著下調(diào)，油酸含量由40%上升為72.9%。Peng［20］等構(gòu)建了RNAis雙元干擾載體，同時(shí)沉默F(xiàn)AD2基因和FAE1基因得到了油酸85%以上，其他多元不飽和脂肪酸在10%以下，與遺傳背景差別大的GX品系雜交得到的子代的脂肪酸含量能穩(wěn)定遺傳。

FAD2基因的拷貝數(shù)和拷貝具體的位置在油菜中尚不明確，目前主要是通過定位同源基因所在BAC的位置的方法。Jung等［21］在白菜型油菜中通過全基因組掃描白菜EST數(shù)據(jù)庫獲得了兩個(gè)FAD2拷貝，BrFAD2－1和 BrFAD2－2，分別位于KBrB063G23和 KBrH113N10兩個(gè) BAC。其中BrFAD2－2在白菜型油菜中產(chǎn)生了一個(gè)終止子的突變而造成在白菜型油菜中不表達(dá)，他通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)BrFAD2－1是一個(gè)有功能的拷貝。Scheffler等［22］利用Southern雜交發(fā)現(xiàn)在甘藍(lán)型油菜中FAD2基因有4～6個(gè)拷貝，其中4個(gè)拷貝被分別定位在同源的A1 和 C1、A5 和 C5 連鎖群。Smooker［23］用 DH 群體構(gòu)建遺傳圖譜，通過與脂肪酸合成相關(guān)的基因所在白菜BAC，設(shè)計(jì)與脂肪酸合成相關(guān)的擬南芥同源標(biāo)記并將它們定位在連鎖圖上，其中3個(gè)FAD2候選基因分別定位于 A1、C1、A5、C5，其中 C1的 FAD2同源標(biāo)記落在油酸QTL(數(shù)量性狀基因座)置信區(qū)間內(nèi)，C5的 FAD2同源標(biāo)記是根據(jù) BAC KBrB063G23設(shè)計(jì)。楊燕宇等［24］通過高油酸品系HOP和湘油15構(gòu)建F2無芥酸群體進(jìn)行油酸QTL定位，在遺傳背景上排除了芥酸的干擾，用單株法和半粒法都發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)跟油酸相關(guān)的QTL，分別在A5和C5上。A5上QTL與FAD2基因緊密連鎖(來源于白菜的 FAD2 BAC KBrB063G23)，與 C5上 QTL區(qū)域緊密連鎖的標(biāo)記 BRP06Y06－a(BAC KBrB087P06)在A5 QTL區(qū)域有同源標(biāo)記，因此推測(cè)這兩個(gè)QTL分別對(duì)應(yīng)兩個(gè)相應(yīng)的FAD2。Hu等［25］通過擬南芥中的FAD2同源標(biāo)記［26］，在甘藍(lán)型油菜高油酸親本和低油酸親本中分別擴(kuò)增得到FAD2基因克隆并測(cè)序設(shè)計(jì)特異基因標(biāo)記。隨后將FAD2基因標(biāo)記定位在了連鎖圖上，其中A5上的基因標(biāo)記落在了油酸主效QTL的置信區(qū)間內(nèi)，還在C1上定位了一個(gè)較小的QTL。Jagannath等［27］將基因特異標(biāo)記 FAD2－1(設(shè)計(jì)自 B.rapa，定位 A基因組FAD2)，F(xiàn)AD2－2(設(shè)計(jì)自B.nigra，定位B基因組FAD2)分別定位在芥菜型油菜遺傳圖譜中的A5和B1連鎖群，可惜油酸的QTL并未定位在FAD2基因標(biāo)記所在連鎖群。FAD2拷貝能夠分為種子特異表達(dá)和在植物中多個(gè)組織表達(dá)兩種，而且可能存在假基因。肖鋼等［28］通過對(duì)甘藍(lán)型油菜FAD2 PCR克隆產(chǎn)物測(cè)序的方式，得到了11個(gè)不同的FAD2拷貝，6個(gè)拷貝在編碼區(qū)域出現(xiàn)終止密碼子，另外5個(gè)的同源性為90.6%～99.74%。11個(gè)拷貝通過同源性不同分為兩組，命名為FAD2Ⅰ和FAD2Ⅱ。RT－PCR結(jié)果表明在授粉后27 d的種子中FAD2Ⅰ表達(dá)，F(xiàn)AD2Ⅱ不表達(dá)。在葉片中兩者都表達(dá)。肖鋼等［29］將上述6個(gè)出現(xiàn)終止密碼子的FAD2拷貝進(jìn)行了酵母表達(dá)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)這6個(gè)拷貝沒有改變酵母脂肪酸組成，推測(cè)這6個(gè)拷貝為假基因。

表1 不同作物的FAD2拷貝情況

根據(jù)上述文獻(xiàn)，筆者認(rèn)為在芥酸合成途徑受阻的前提下，F(xiàn)AD2基因是影響油酸的關(guān)鍵基因，并且在3種油菜中的FAD2都存在多拷貝，并且在克隆FAD2中可能會(huì)遇到假基因。其中白菜型油菜證實(shí)存在1個(gè)FAD2拷貝指向A5，甘藍(lán)型油菜有4～6個(gè)FAD2拷貝，其中A5上確定有一個(gè)有功能的FAD2，而在C5、A1、C1上存在FAD2基因，可沒有相關(guān)功能的報(bào)道。在芥菜型油菜中A5、B1上也可能分別有一個(gè)FAD2拷貝。

油菜中FAD2的拷貝數(shù)和拷貝分布都不是很明確，這對(duì)提高油酸含量和進(jìn)一步分析脂肪酸合成調(diào)控造成了困難。但模式植物擬南芥和其他油料作物的FAD2序列信息和功能研究為研究油菜的FAD2基因提供了良好的資料。而近期白菜的測(cè)序完成［30］和甘藍(lán)物理圖譜的構(gòu)建［31］，為我們提供了更多的信息。在脂肪酸去飽和中研究較深入的有擬南芥、玉米、大豆、棉花、芝麻等作物。

如表1所示，可以看出FAD2拷貝的作用模式可能為1～2個(gè)在種子中特異表達(dá)的拷貝在油酸向亞油酸轉(zhuǎn)變的過程中起主要作用，其他拷貝在全部組織中低表達(dá)。不同拷貝可能受溫度影響大小不一。不同物種FAD2不一樣，例如紅花FAD2的熱穩(wěn)定性要比向日葵高［32］。拷貝間差異主要集中在3'和5'非編碼區(qū)。相比這些作物，我們只知道在油菜中A5上有一個(gè)有確定功能的FAD2，即在種子中特異表達(dá)的拷貝。其他拷貝在油菜中的位置尚不太清楚，具體的拷貝數(shù)未確定，其他拷貝對(duì)油酸含量的影響效果和在不同環(huán)境下的表達(dá)效果都不甚清楚。因此，首先要確定FAD2基因各拷貝在染色體中的具體位置，然后分析這些拷貝的主要功能和結(jié)構(gòu)。FAD2基因的非編碼區(qū)、啟動(dòng)子以及FAD2逆境表達(dá)是油菜今后研究的重點(diǎn)。

2.2 FAE1基因

FAE1(芥酸合成酶)在非雙低油菜中是影響油酸的主要基因［4］。近十年來，F(xiàn)AE1基因在區(qū)分不同拷貝，和在序列水平上分析基因功能上取得了一定的進(jìn)展。眾多的研究表明，在甘藍(lán)型油菜中芥酸的QTL 是定位在 A8 和 C3 上［43～45］，分別對(duì)應(yīng)兩個(gè)FAE1的拷貝 FAE1.1和 FAE1.2。Gupta等［45］從芥菜型高芥酸油菜和低芥酸油菜中分離出兩個(gè)拷貝FAE1.1、FAE1.2，發(fā)現(xiàn)高芥酸和低芥酸品種之間存在4個(gè)SNP位點(diǎn)，F(xiàn)AE1.2存在3個(gè)SNP。中國(guó)發(fā)現(xiàn)了不同于以往ORO(德國(guó)低芥酸種質(zhì))的新雙低種質(zhì)資源中雙9號(hào)。Wu等［46］通過FAE1亞型(缺失4對(duì)堿基)酵母表達(dá)和轉(zhuǎn)基因油菜證實(shí)中雙9號(hào)是由于FAE1基因的4對(duì)堿基缺失導(dǎo)致移碼，翻譯提前終止造成的，這種現(xiàn)象主要出現(xiàn)在C基因組。徐愛遐等［47］利用同源序列法對(duì)6個(gè)芥菜型油菜品種(高芥酸、中芥酸、低芥酸)、2份白菜型油菜品種(高芥酸和低芥酸)和1份黑芥品種的FAE1基因進(jìn)行克隆和測(cè)序，得到9個(gè)品種的FAE1基因編碼區(qū)全長(zhǎng)均為1 522 bp，不含內(nèi)含子，均編碼507個(gè)氨基酸殘基。芥菜型油菜中有兩種FAE1基因序列(BjFAE1.1和BjFAE1.2)，其親緣種白菜型油菜和黑芥各有一種FAE1基因序列(BrFAE1和BnFAE1)，分別對(duì)應(yīng)芥菜中的 BjFAE1.1和BjFAE1.2 。Wang［48］用 Ecotilling 技術(shù)檢測(cè)白菜型油菜、甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜，找到了一個(gè)導(dǎo)致FAE1基因功能喪失的SNP位點(diǎn)，還發(fā)現(xiàn)編碼FAE1的編碼序列有18個(gè)SNP可以區(qū)分A、C基因組。比較不同芥酸含量油菜的 FAE1基因序列，BjFAE1.1和BjFAE1.2都存在兩個(gè)SNP。

3 新技術(shù)和新方法對(duì)研究控制油酸基因的啟示

脂肪酸含量是一個(gè)數(shù)量性狀，這使得它的研究具有一定的復(fù)雜性，但現(xiàn)代生物信息學(xué)的發(fā)展和分子生物學(xué)的進(jìn)步對(duì)挖掘數(shù)量性狀下隱藏的基因，提供了條件。

電子克隆和電子定位通過利用大量的EST等數(shù)據(jù)，縮小了實(shí)驗(yàn)范圍，使得實(shí)驗(yàn)的速度大大加快。在大豆中，Sharma［49］利用比較擬南芥、甘藍(lán)型油菜、蓖麻子、大豆中261個(gè)脂肪酸合成、油脂合成相關(guān)的基因得到了一張電子表達(dá)譜，該電子表達(dá)譜顯示一些脂肪酸代謝重要基因(如FAD2)有異常的分離。Chi［50］通過電子克隆的方法分離了大豆中29個(gè)減飽和基因，并將他們?cè)谌旧w中的分布進(jìn)行了預(yù)計(jì)。我國(guó)的玉米研究領(lǐng)域在脂肪酸［51］和株高［52］方面，也做了一些類似的研究，獲得了一些表達(dá)譜和候選基因。

利用EST序列拼接能發(fā)現(xiàn)新的基因。Schlueter［39］利用大豆的EST序列發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)新的FAD2基因，并證實(shí)其中FAD2－c是控制低溫下亞油酸合成的FAD2基因。Jung等［21］通過掃描白菜型油菜EST序列庫分離出了BrFAD2－1基因。

另外，我們可以通過挖掘高密度圖譜下已定位的QTL，來獲得一些相關(guān)基因。方法有關(guān)聯(lián)分析結(jié)合連鎖分析［15］、功能標(biāo)記解析［53，54］，通過這些方法能夠?qū)?shù)量性狀和基因關(guān)聯(lián)起來，從而發(fā)現(xiàn)和克隆更多脂肪酸相關(guān)基因。研究QTL區(qū)域中的候選基因，利用近等基因系在不同環(huán)境下的表現(xiàn)，采取blot hybidization(印跡雜交)結(jié)合 RT －PCR［55］或者基因芯片技術(shù)［56］能夠更深入了解QTL區(qū)域中各個(gè)基因的代謝調(diào)節(jié)以及基因與環(huán)境的互作。

在高油酸油菜的育種方面還應(yīng)注意利用大規(guī)模回交育種，構(gòu)建油菜高油酸的導(dǎo)入系群體，利用導(dǎo)入系能更為靈敏地發(fā)現(xiàn)一些微效QTL。黎志康［57］曾對(duì)水稻的分子育種體系的建立做了綜述，后來他在利用水稻回交導(dǎo)入系研究耐鹽［58］、抗旱［59］、抗紋枯病［60］QTL等取得了一定進(jìn)展。總之，如何利用現(xiàn)有的生物學(xué)信息數(shù)據(jù)庫，提高檢測(cè)QTL靈敏度，并進(jìn)一步挖掘QTL中影響性狀的基因是研究像油酸含量這類性狀一個(gè)值得思考的問題。

4 展望

提高油酸含量是油菜品質(zhì)育種的重要目標(biāo)。通過抑制FAD2基因可以獲得油酸含量80%的油菜。油菜脂肪酸合成網(wǎng)絡(luò)很復(fù)雜，想通過抑制FAD2基因以獲得85% 以上油酸含量的油菜很困難。一方面，可能是FAD2基因在許多物種中為多拷貝，要想完全抑制FAD2有一定的難度。更重要的一方面，生物是一個(gè)系統(tǒng)，就FAD2基因來說還有許多別的功能。Zhang［61］證實(shí)FAD2的功能在擬南芥的早期萌發(fā)和生長(zhǎng)中是有作用的。因此一味的抑制FAD2表達(dá)可能不利于種子萌芽及植株的整體生長(zhǎng)。另外，在特定環(huán)境下還可能有其他基因控制油酸含量。Song［62］在擬南芥中發(fā)現(xiàn)在低溫下，有一個(gè)控制生育酚相關(guān)的基因sve1是FAD2的等位基因，在一定的低溫條件下，通過抑制sve1，能顯著提高油酸含量。因此是否還有像這樣的基因調(diào)節(jié)油酸的生成是一個(gè)值得思考的問題。這說明考慮脂肪酸合成途徑還應(yīng)重視與其它生化反應(yīng)的關(guān)聯(lián)和調(diào)控，從而取得更加深入的進(jìn)展。

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