重組人酸性成纖維細胞生長因子脂質體的制備及其物理穩定性評價

滕 躍，田海山，張 睿，焦 悅，李校堃

（1.吉林農業大學生物反應器與藥物開發教育部工程研究中心，吉林長春 130118；2.吉林農業大學生命科學學院，吉林 長春 130118；3.溫州醫學院，浙江 溫州 325035）

重組人酸性成纖維細胞生長因子脂質體的制備及其物理穩定性評價

滕 躍1，2，田海山1，3，張 睿1，焦 悅1，李校堃1，3

（1.吉林農業大學生物反應器與藥物開發教育部工程研究中心，吉林長春 130118；2.吉林農業大學生命科學學院，吉林 長春 130118；3.溫州醫學院，浙江 溫州 325035）

目的：確立重組人酸性成纖維細胞生長因子（rhaFGF）脂質體制備的最佳處方及工藝條件，研究其理化性質。方法：采用凍干再水化法，以磷脂與膽固醇質量之比、緩沖溶液pH值和均質時間為單因素，每個因素選取三水平進行實驗，以藥物包封率、物理穩定性和生物活性作為評價指標，確立優化脂質體制備的最佳處方及工藝條件。結果：采用最佳處方工藝條件，即磷脂與膽固醇的比例為20∶1，磷酸鹽緩沖液pH值為6.5，高壓均質時間為20min制備的rhaFGF脂質體，經測定其包封率（En）達81.79%±2.51%，物理穩定性參數（KE）為1.050%±0.342%，生物學活性為（6.521 0±0.617 1）×105U·mL－1，粒子大小較均勻，粒徑大多分布在100nm左右。結論：通過優化工藝條件制備的rhaFGF脂質體包封率高，在4℃保存條件下，滲漏率低且具有很好的物理穩定性及生物學活性。

重組人酸性成纖維細胞生長因子；脂質體；包封率；滲漏率

成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factors，FGF）是一個多肽類生長因子家族，現已發現24個成員，重組人酸性成纖維細胞生長因子（recombinant human acidic fibroblast growth factor，rhaFGF）為成纖維細胞生長因子家族中的一員。作為一個高度保守的功能蛋白，rhaFGF不但具有促進創傷愈合、神經組織修復以及胚胎發育與分化等方面的作用，而且還具有舒張血管、缺血保護、促血管內皮細胞及平滑肌細胞增殖、分化和遷移作用［1－2］。研究結 果［3－6］表 明：rhaFGF 在心臟缺血和冠心病中對新生血管形成過程中的多個環節，如毛細血管基底膜降解、膠原合成和小血管腔形成等均有明顯促進作用，而冠心病的發生與上述因素的抑制和異常存在著密切的關系。rhaFGF作為一種蛋白類藥物與傳統的藥物相比具有用藥劑量小、療效好、毒副作用低等突出優點，但是其體內外的不穩定性以及蛋白類藥物半衰期短、清除率高，易受體內酶和體液的破壞等因素限制了多肽、蛋白類藥物的應用［7］。因此，找到一種安全、有效和穩定的轉運蛋白類藥物的給藥系統是目前生物技術藥物所面臨的一個重大難題。

脂質體（liposome）是一種將藥物包封于類脂雙分子層中所形成的超微型球狀載體制劑，是一種定向藥物載體，屬于靶向給藥系統。由Bangham于20世紀60年代中期提出，迄今已廣泛應用于生物化學、生物物理學等各種科學領域，并且脂質體作為藥 物 傳 遞 系 統 已 廣 泛 應 用 于 臨 床［8－10］。自Gregoriadis等利用脂質體作為藥物載體以來，脂質體作為一種新型的藥物載體的研究與應用迅速發展，脂質體載藥技術日趨成熟。因此本文作者確立了rhaFGF脂質體制備的最佳處方及工藝條件，以期為冠心病的治療開辟一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

rhaFGF原液（本實驗室制備并保存）；德固賽大豆磷脂（SPC，德國嘉吉公司）；膽固醇（北京鼎國生物技術有限公司）；NIH 3T3細胞（本實驗室保存）；化學試劑均為國產分析純。

1.2 實驗儀器

冷凍干燥機（VirTis公司）；低溫高速離心機（BECKMAN COULTER Avanti J－26XP）；掃描電子顯微鏡S－3400N（日本，日立公司）；激光粒度分析儀；KQ－250DB型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；ZFQ 85A型旋轉蒸發儀；AH－100高壓均質機（加拿大，ATS公司）；S20K pH指示劑（德國，梅特勒公司）；PLUS384酶標儀（美國，美國分子生物公司）；Waters型高效液相色譜儀（美國，Waters公司）；色譜柱DiamonsiTM （鉆 石）C18，5 μm，250mm×4.6mm（Dikma公司）。

1.3 rhaFGF脂質體的制備及鑒定

1.3.1 rhaFGF脂質體的制備 用凍干再水化法制備脂質體（FRV）。精密稱取大豆卵磷脂1.00g與膽固醇0.05g，溶于50mL三氯甲烷中，超聲震蕩10min后，加入75mL乙醚與25mL三氯甲烷（此過程處于超聲震源處并需防止水濺入，注意封口防止揮發），滴加0.02mol·L－1、pH7.0的磷酸鹽緩沖溶液50mL，超聲至不分層，形成乳白色油包水化體后進行旋轉蒸發，蒸發過程中相變，變成水包油，即得脂質體。隨后在1 200～1 500bar條件下高壓均質15～30min，依次采用1.00、0.60、0.45、0.22 μm 濾 膜 進 行 整 粒， 加 入rhaFGF于37℃孵育15min后加入附形劑混合分裝，－40℃預凍2h，冷凍干燥24h后4℃、25℃、37℃保存，使用時加注射用水水化即得rhaFGF脂質體。

1.3.2 SDS－PAGE電泳－銀染法對rhaFGF脂質體進行鑒定 精密吸取rhaFGF脂質體樣品100μL，加入過量的NaCl，振搖后，加入氯仿300μL振搖混合均勻，8 000r·min－1離心分離10min，取上清液，PB（pH6.5）稀釋10倍，加入相同體積的上樣緩沖液，沸水浴加熱10min，12 000r·min－1離心分離10min。用微量進樣器吸取20μL上樣，同時加蛋白Marker、空白脂質體和rhaFGF原液作為對照。

1.3.3 脂質體制備工藝優化 通過單因素考察對脂質體處方進行優化，A：磷脂與膽固醇質量之比；B：磷酸鹽緩沖溶液pH值；C：高壓均質機均質時間。經單因素實驗預試，選取影響包封率因素，每個因素選取三水平進行實驗，以藥物包封率、物理穩定性和生物活性作為評價指標。

1.4 脂質體的評價方法

1.4.1 形態學及粒徑分布 采用掃描電鏡對rhaFGF脂質體樣品形態學觀察。取rhaFGF脂質體樣品滴加于樣品臺上，干燥完全后抽真空達4Pa，調節放電電壓（1 200～1 400V），電流5～6mA進行鍍膜，厚度約10nm。將樣品放入掃描電鏡中，抽真空為5×10－3Pa，調節電鏡的加速電壓、工作電流及工作距離，對樣品進行觀察。先在低放大倍數下對電鏡進行粗略的聚焦，然后調整樣品位置，調高放大倍數直到樣品形態清晰，迅速聚焦并照相。采用激光散射法進行脂質體粒度的分析。首先用蒸餾水將激光粒度分析儀調零調平后，使用微量進樣器取10mL rhaFGF脂質體樣品緩慢加入到進樣口中，等待激光粒度分析儀檢測粒徑大小及粒度分布情況并制圖。

1.4.2 包封率（En）的測定 取2mL rhaFGF脂質體樣品置于10mL定量瓶中，用二甲亞砜定溶，再以95%乙醇稀釋10倍，搖勻，用HPLC定量。按下式計算包封率：En（%）＝（We／Wt）×100%，其中We和Wt分別代表被包封入脂質體中的rhaFGF量和總rhaFGF量。

1.4.3 穩定性的測定 采用離心－分光光度法測定物理穩定性參數（KE），精密吸取rhaFGF脂質體樣品1mL，置離心管中3 200r·min－1離心10min，取離心前的脂質體及離心后的上清液各0.3mL，分 別 加 磷 酸 鹽 緩 沖 液 （pH 6.5，0.02mol·L－1）稀釋至5.0mL，以磷酸鹽緩沖液為空白，于波長280nm處測定吸光度（脂質體離心前后測得的吸光度值分別為A0和A），計算物理穩定性參數KE值。KE＝（A0－A）／A0×100%，KE值越小，說明脂質體越穩定。

1.4.4 脂質體滲漏率測定 采用SephadeX G－50分子排阻色譜法將載藥脂質體與游離藥物分開，再將載藥脂質體混懸液分別置于4℃、25℃、37℃保存，間隔一定的時間用HPLC方法測定藥物滲漏率（Q滲）。Q滲（%）＝（放置前介質中的藥物量－放置后介質中的藥量）／制劑中藥量×100%。

1.4.5 生物活性的測定 采用 MTT法測定［11］rhaFGF脂質體和rhaFGF原液。用含0.5%血清的DMEM培養液稀釋至0.1mg·L－1，精密吸取100μL加入第1孔，依次4倍稀釋，每個稀釋度設2個復孔；rhaFGF標準品初始計量為100U，并設空白脂質體基質對照，在酶標儀上以630nm為參比波長，于波長570nm處測定A值，計算rhaFGF脂質體的生物學活性。

2 結 果

2.1 rhaFGF脂質體鑒定

采用SDS－PAGE電泳－銀染法對rhaFGF脂質體進行鑒定，空白脂質體泳道中未見rhaFGF條帶，rhaFGF脂質體泳道中在與rhaFGF原液的泳道的相同位置有相應的條帶。見圖1。

圖1 SDS－PAGE法測定rhaFGF脂質體Fig.1 rhaFGF liposomes measured by SDS－PAGE

2.2 處方優化實驗結果

以En、KE和生物活性為指標，采用單因素考察方法運用凍干再水化法制備的rhaFGF脂質體樣品。以最佳處方工藝條件：即磷脂與膽固醇的比例為20∶1，磷酸鹽緩沖液pH值為6.5，高壓均質時間為20min制備的rhaFGF脂質體，經測定其En達 （81.79 ± 2.51）%， KE為 （1.05 ±0.342）%，生物活性效價為 （6.521±0.617）×105U·mL－1。見表1～3。

2.3 rhaFGF脂質體形態學及粒徑分布

掃描電鏡觀察：rhaFGF脂質體形狀較規則，呈現圓球形或橢圓球形囊泡；粒子大小較均勻，粒徑范圍約在100nm （圖2）。

表1 不同磷酸和膽固醇比例組脂質體En、KE和生物活性的變化Tab.1 Changes of En，KEand bioactivity of rhaFGF liposomes in phospholipid and cholesterol with different ratios groups （n＝4，±s）

表1 不同磷酸和膽固醇比例組脂質體En、KE和生物活性的變化Tab.1 Changes of En，KEand bioactivity of rhaFGF liposomes in phospholipid and cholesterol with different ratios groups （n＝4，±s）

SPC∶Chol En（η／%） KE（η／%） Bioactivity（λB／×105 U）10∶1 65.81±4.51 0.88±0.35 6.52±0.69 20∶1 80.79±3.66 0.96±0.67 7.02±0.80 30∶1 78.90±1.93 1.00±0.24 7.24±0.17

表2 不同pH值組脂質體En、KE和生物活性的變化Tab.2 Changes of En，KEand bioactivity of rhaFGF liposomes in different PH values groups （n＝4，±s）

表2 不同pH值組脂質體En、KE和生物活性的變化Tab.2 Changes of En，KEand bioactivity of rhaFGF liposomes in different PH values groups （n＝4，±s）

pH En（η／%） KE（η／%） Bioactivity（λB／×105 U）6.0 70.66±8.51 0.97±0.30 6.52±0.69 6.5 78.79±4.73 0.94±0.61 7.56±0.21 7.0 79.24±4.97 1.04±0.69 6.02±0.58

表3 不同粒徑分布組脂質體En、KE和生物活性的變化Tab.3 Changes of En，KEand bioactivity of rhaFGF liposomes in different particle size distribution groups（n＝4，±s）

表3 不同粒徑分布組脂質體En、KE和生物活性的變化Tab.3 Changes of En，KEand bioactivity of rhaFGF liposomes in different particle size distribution groups（n＝4，±s）

Time（t／min） En（η／%） KE（η／%） Bioactivity（λB／×105 U）15 75.81±4.51 0.99±0.29 6.82±0.25 20 82.41±3.27 0.88±0.26 7.92±0.89 30 82.90±6.39 0.83±0.79 4.24±0.93

圖2 rhaFGF脂質體掃描電鏡觀察結果Fig.2 The observation results of rhaFGF liposome by scanning electron microscope

2.4 穩定性考察

分別測定rhaFGF脂質體在4℃、25℃和37℃條件下保存30d后的En、KE、Q滲及生物活性的變化情況。結果表明：本實驗制備的rhaFGF脂質體在4℃條件下較為穩定，En、KE及生物學活性變化不大，而在25℃和37℃條件下不易穩定存在。見表4。

圖3 rhaFGF脂質體平均粒徑分布Fig.3 Average particle size distribution of rhaFGF liposome

2.5 生物活性的測定

采用MTT法測定rhaFGF脂質體的生物活性，結果見圖4。由圖中可見：rhaFGF脂質體樣品對NIH 3T3細胞有促增殖作用，且與aFGF標準品生物學活性基本一致。

表4 不同溫度下脂質體En、KE、Q滲和生物活性的變化Tab.4 Changes of En，KE，Q，and bioactivity of rhaFGF liposomes at different temperatures （n＝4，±s）

表4 不同溫度下脂質體En、KE、Q滲和生物活性的變化Tab.4 Changes of En，KE，Q，and bioactivity of rhaFGF liposomes at different temperatures （n＝4，±s）

“－”：No data.

T（θ／℃） En（η／%） KE（η／%） Q（η／%） Bioactivity（λB／×105 U）4 71.16±0.97 2.87±0.08 8.2±1.2 7.92±0.89 25 61.84±0.53 9.98±0.36 20.8±3.1 6.93±0.88 37 45.58±1.89 21.58±0.75 35.6±4.6—

圖4 各組NIH 3T3細胞生物活性的變化Fig.4 Changes of bioactivities of NIH 3T3cells in various groups

3 討 論

多肽、蛋白類藥物大多為內源性物質，這些活性蛋白在體內含量極微，但參與和調控許多重要的生理學功能，針對性強、效果顯著，特別是在治療和預防嚴重威脅生命的疾病方面發揮愈來愈重要的作用。但這些物質一般穩定性較差，易在酸堿環境中被破壞或在體內酶解。另外，此類藥物在體內生物半衰期短，給藥后在血中消除很快，難以充分發揮其應有的藥理作用［11－12］。

脂質體作為一種新型的藥物傳遞系統，具有以下優勢：①增強多肽、蛋白類藥物體內外的穩定性的作用；②包裹多肽、蛋白類藥物在體內延緩釋放，可延長藥物的半衰期；③用于多肽、蛋白類藥物的載體，可以實現藥物的靶向給藥；④局部運用可增加藥物與局部組織的親和性，減少刺激［13］。這些優點為多肽、蛋白質類藥物應用，尤其在穩定性、延長體內半衰期及靶向給藥領域發揮著越來越大的作用，有著廣闊的應用前景。做為新型藥物載體，隨著在材料、制備方法、制備工藝、給藥途徑等方面逐步走向完善，為該類藥物制劑的產業化生產奠定了良好的基礎。

本實驗通過優化工藝條件制備的rhaFGF脂質體包封率較高，且具有很好的物理穩定性及生物學活性。本課題組將在本次實驗的基礎上，進一步研究rhaFGF脂質體注射體內后，其穩定性、半衰期及藥物釋放度，并進一步研究其對心肌缺血性冠心病的治療效果。

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Preparation of rhaFGF liposomes and evaluation of their physical stability

TENG Yue1，2，TIAN Hai－shan1，3，ZHANG Rui1，JIAO Yue1，LI Xiao－kun1，3
（1.Engineering Research Center of Bioreactor and Pharmaceutical Development，Ministry of Education，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；2.College of Life Science，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；3.Wenzhou Medical College，Wenzhou 325035，China）

Objective To optimize the prescription and preparation of recombinant human acidic fibroblast growth factor（rhaFGF）liposomes，and to study the physical and chemical properties.Methods The encapsulation efficiency and biological activity of rhaFGF liposomes were evaluated by single factor test.Freeze－drying－rehydration was used to obtain the optimum prescription and preparation of rhaFGF liposomes.Results The encapsulation efficiency of rhaFGF liposomes was（81.79±2.51）%，the physical stability index（KE）was（1.050±0.342）%and the bioactivity was（6.521 0±0.617 1）×105U·mL－1.The particle size was about 100nm uniformly.Conclusion The preparation of rhaFGF liposomes is optimized，and these liposomes have high encapsulation efficiency，good physical stability and high bioactivity at 4℃.

recombinant human acidic fibroblast growth factor；liposome；encapsulation efficiency；percolation ratio

R94

A

1671－587Ⅹ（2012）05－0932－05

2012－04－24

吉林省教育廳科研基金資助課題 ［2009（65）］

滕 躍 （1985－），女，內蒙古自治區突泉縣人，在讀生物化學與分子生物學碩士，主要從事基因工程制藥的研究。

田海山 （Tel：0577－86689983，E－mail：tianhaishan332＠sina.com）；李校堃 （Tel：0431－84533348，E－mail：xiaokunli＠163.net）