巴斯德畢赤酵母表達的人抑瘤素M發酵條件及發酵產物分析

孔 寧，高海成，劉國民，陳 月，周余來，顏煒群

（1.吉林大學藥學院醫用生物材料學教研室，吉林 長春 130021；2.吉林大學藥學院臨床藥學與藥事管理學教研室，吉林 長春 130021；3.吉林大學第二醫院骨科，吉林 長春 130041）

巴斯德畢赤酵母表達的人抑瘤素M發酵條件及發酵產物分析

孔 寧1，高海成2，劉國民3，陳 月1，周余來1，顏煒群1

（1.吉林大學藥學院醫用生物材料學教研室，吉林 長春 130021；2.吉林大學藥學院臨床藥學與藥事管理學教研室，吉林 長春 130021；3.吉林大學第二醫院骨科，吉林 長春 130041）

目的：研究巴斯德畢赤酵母表達的人抑瘤素M（hOSM）大規模發酵條件。方法：利用hOSM畢赤酵母高表達菌株，于試管水平進行發酵pH條件的摸索，以補料分批培養方式在80L發酵罐中對hOSM工程菌進行3個批次的高密度發酵，控制和優化各種發酵條件，通過SDS－PAGE對發酵產物進行分析。結果：最終確定在pH 5.0的FM21培養基中擴增菌體，待菌體密度達190g·L－1時添加甲醇誘導，在發酵液pH 5.5的條件下，發酵溫度穩定在28℃，通入空氣的流量為2vvm，轉速為650r·min－1，罐內壓力為10P，溶解氧保持在25%左右，甲醇流加速度在9.3mL·h－1·L－1初始發酵液體積，誘導36h時結束發酵，hOSM占分泌總蛋白的28%，產量達到280mg·L－1。結論：應用hOSM工程菌能夠進行穩定的發酵，為進行下一步生物學功能測定提供充足的物質基礎。

抑瘤素M；畢赤酵母；發酵

抑瘤素 M（oncostatin M，OSM）是一種相對分子質量約為28 000的細胞生長調節因子，屬于白細胞介素6（IL－6）家族中的一員，該家族成員之間顯示出相似的生物學功能，并均通過受體gp130亞單位進行信號傳遞［1］。OSM具有廣泛的生物學活性，包括參與炎癥反應、神經元再生、造血作用、重塑細胞外基質及抑制多種腫瘤細胞的增殖等［2］。有報道［3－4］顯示：OSM對肺癌、胃癌、骨肉瘤、肝癌等還具有抑制其生長并誘導其分化的作用。健康人血清中OSM含量僅為24ng·L－1，故人們嘗試通過大腸桿菌［5］及哺乳動物細胞［6］等表達系統來獲取OSM，但表達量均較低，無法滿足對OSM的大量需求。畢赤酵母表達系統能在甲醇誘導下進行連續發酵，表達水平穩定，易于放大培養，適用于大規模工業化高密度發酵工藝，培養成本低廉，自身分泌的蛋白非常少，且可以分泌表達，十分有利于產物分離純化［7］。同時，畢赤酵母表達系統還不存在原核表達系統的內毒素難以除去的問題，也不存在哺乳動物細胞表達系統的病毒和支原體污染等問題。本課題組前期已構建了畢赤酵母分泌型表達載體pPICZαC－hOSM，并獲得了hOSM的高表達菌株［8］。在搖瓶規模發酵表達的基礎上，本次研究進一步利用80L發酵罐對hOSM工程菌進行發酵，并對其發酵條件進行優化，為OSM的產業化生產及未來臨床應用奠定物質基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、主要試劑及儀器

巴斯德畢赤酵母hOSM菌株（PichiapastorisX33／Mut＋）由本室構建并保存。YPD、BMGY、BMMY、FM21和PTM1培養基均采用Invitrogen公司提供的配方配制；蛋白質相對分子質量Marker（低）購自TaKaRa公司；Bioflo 5000發酵罐購自NewBrunswick Scientific公司；恒溫搖床購自Forma Scientific公司；凝膠分析系統購自Pharmacia公司；發酵用其他試劑均為北京化學試劑廠產品。

1.2 畢赤酵母表達hOSM的pH值優化

選取表達量最高的酵母菌株，分別在pH 2.5～6.5的范圍內以0.5個單位為間隔進行培養基pH值的優化實驗。將選取菌株，于10mL YPD培養基中30℃、250r·min－1振蕩培養24h。分別取BMGY 8mL，加入1mL由1mol·L－1Na2HPO4和0.5mol·L－1檸檬酸配制成不同pH值的緩沖液，混勻后各加入1mL YPD培養的工程菌菌液，30℃、250r·min－1振蕩培養30h，使其光密度（A）600＝5。室溫3 000r·min－1離心5min，棄上清，沉淀中各加入BMMY 8mL，再加入1mL不同pH值的上述緩沖液，30℃、250r·min－1振蕩培養，每24h補充1次甲醇至終濃度0.5%，同時補充滅菌去離子水，使發酵液總體積保持不變，誘導168h。分別取不同pH值的發酵液各0.5mL，離心取上清，進行SDS－PAGE分析。

1.3 種子液培養

將凍存的hOSM工程菌在YPD瓊脂板上（含zeocin 100mg·L－1）30℃劃線培養。至菌落長至約2mm，挑取單克隆菌落加入到10mL YPD培養液中，30℃、250r·min－1振蕩培養24h。將上述培養物加入到2LYPD培養液中，30℃、250r·min－1振蕩培養24h，至A600＝10。

1.4 酵母細胞生物量的積累

配制40LFM21培養基，加入80L發酵罐中，121℃、30min高壓滅菌。待發酵罐內培養基冷卻到28℃，用氨水調節FM21培養基pH值至5.0，加入48mL PTM1和18mL生物素貯備液。將2LYPD種子液倒入發酵罐中開始培養，此為第1階段即甘油培養擴增菌體，發酵罐參數為：攪拌速度600r·min－1，罐內壓力10P，溫度28℃，控制方式均為P－I－D，維持溶解氧值（DO）在25%～30%，必要時通入純氧。24h后DO值上升至接近100%時，按每升培養基加入12mL PTM1的比例在高壓滅菌后的50%甘油中加入PTM1，混勻后以18.2mL·h－1·L－1初始發酵液的速率泵入發酵罐中，至菌體濕重達190g·L－1。停止補加甘油后，待DO值上升至接近100%后，繼續維持“甘油饑餓”狀態30min，轉入甲醇誘導階段。

1.5 甲醇補料誘導hOSM表達

調節pH至最適誘導pH值，按照12mL·L－1比例在甲醇中加入PTM1，混勻后以3.6mL·h－1·L－1初始發酵液的速率加入到發酵罐中誘導表達，維持此低速率3h，以使酵母適應以甲醇為唯一碳源的環境。DO值穩定后，甲醇的速率升為7.2mL·h－1·L－1初始發酵液，以此速率維持2h。之后提高補加甲醇的速率至10mL·h－1·L－1初始發酵液，同時檢測DO值和發酵液溫度，并判斷甲醇是否過量。若碳源受限，則加快補加甲醇的速率；若甲醇過量，則減慢補加甲醇的速率，直至合適的速度。甲醇誘導表達階段，每隔6h取樣1次，分析酵母菌生長狀態。甲醇誘導表達60h后結束發酵。

1.6 菌體光密度值分析

發酵液適當稀釋后于可見光波長600nm，以去離子水為對照進行比色測定，A600＝讀值×稀釋倍數。

1.7 菌體濕重分析

取發酵不同時期的發酵液1mL，13 000r·min－1離心5min，去上清，稱量質量。

1.8 hOSM分析

取發酵不同時期的發酵液0.5mL進行SDS－PAGE分析，采用Band Scan軟件對凝膠圖片進行光密度分析，顯示其純度，并用Bradford法對蛋白進行精確定量。

2 結 果

2.1 試管水平表達hOSM的最佳pH值

在相對分子質量約為28 000處可見hOSM表達，pH在5.5～6.0時表達效果最好，而pH值低于3.0時幾乎無hOSM的表達（圖1）。

圖1 不同pH條件下rhOSM發酵上清SDS－PAGE分析Fig.1 SDS－PAGE analysis of rhOSM fermentation supernatant at different pH values

2.2 hOSM發酵條件優化

2.2.1 hOSM發酵液pH值和甲醇誘導時間的確定 pH值5.5時，添加甲醇即有hOSM的表達，隨著發酵時間的延長目的蛋白表達量逐漸升高，至甲醇誘導36h表達量達到高峰，此后繼續發酵則發酵液中hOSM表達量不僅未增加，反而明顯下降；pH值4.5時，甲醇誘導42h表達量才達到高峰，比pH 5.5條件下高峰出現延遲，且高峰時hOSM表達量也沒有pH 5.5條件下甲醇誘導36h時多；pH值6.5時，hOSM表達量明顯低于其他pH條件，且雜蛋白增加明顯。據此，確定hOSM發酵最佳pH條件為5.5，甲醇誘導時間為36h，hOSM表達量占總蛋白量28%，產量可達280mg·L－1。見圖2～4。

圖2 pH 4.5條件下rhOSM發酵上清SDS－PAGE分析Fig.2 SDS－PAGE analysis of rhOSM fermentation supernatant at pH 4.5

圖3 pH 5.5條件下rhOSM發酵上清SDS－PAGE分析Fig.3 SDS－PAGE analysis of rhOSM fermentation supernatant at pH 5.5

2.2.2 hOSM發酵過程中A600和菌體濕重監測結果 甲醇誘導階段，每隔6h取樣監測A600和酵母細胞濕重。從圖5可以看出菌體濕重和A600在整個發酵過程當中持續增長，18h之前酵母細胞生長相對緩慢。

2.2.3 溫度對hOSM發酵產量的影響 巴斯德畢赤酵母的適宜生長溫度為30℃，若溫度高于32℃對畢赤酵母是致命的。本次研究發酵溫度控制在28℃進行發酵取得了很好的效果。

圖4 pH 6.5條件下rhOSM發酵上清SDS－PAGE分析Fig.4 SDS－PAGE analysis of rhOSM fermentation supernatant at pH 6.5

圖5 pH 5.5條件下rhOSM中試發酵酵母菌發酵液A600、菌體濕重和發酵上清中rhOSM表達產量的經時變化Fig.5 Profile of A600，wet weight，rhOSM production and time course during the methanol induction phase at pH 5.5

2.2.4 甲醇流加速度對hOSM發酵產量的影響對發酵表達hOSM而言，在甲醇流加速度為3.6mL·h－1·L－1時目的蛋白的表達量很少，當甲醇的流加速度增加至7.2mL·h－1·L－1時，目的蛋白的表達量仍舊很低，本研究保持發酵液中甲醇濃度在0.5%～1.0%，甲醇最終的流加速度達到9.3mL·h－1·L－1初始發酵液體積時，hOSM的表達量達到280mg·L－1。

3 討 論

畢赤酵母在分泌表達外源蛋白的時候，培養基的pH條件對外源基因的表達至關重要，尤其在大規模發酵菌體高密度培養時更加突出。培養基pH值不同往往引起酵母菌代謝過程的改變，使表達產物的比例和質量發生改變。確定適合的pH條件，既能提高目的蛋白的產量，又能抑制蛋白水解酶的活性，保持目的蛋白的穩定。本研究所用的培養基為無機鹽類，pH過高易產生沉淀，同時為防止雜菌污染，在甘油擴增階段培養基pH值設定為5.0，而在甲醇誘導表達階段pH值恒定在5.5。

在誘導階段，甲醇既作為畢赤酵母的碳源被攝取，又能作為誘導物誘導外源基因的表達。盡管在一定范圍內外源蛋白的產量與甲醇的飼給量呈正相關，但是甲醇的添加速度并非越快越好，速度過慢，達到目的蛋白產量高峰所需的誘導時間長，表達量低；速度過快，同樣會出現表達量減少，雜蛋白增加［9］。在誘導的早期，一般應從低濃度甲醇逐漸增加至高濃度來進行，甲醇過量會導致畢赤酵母的中毒，其在發酵液中的濃度不應高于2%。對發酵表達hOSM而言，采用補料批式發酵的方法，在菌體濕重達到190g·L－1時進行甲醇誘導，甲醇終流加速度設置為9.3mL·h－1·L－1初始發酵液體積，誘導36h，其表達量可達280mg·L－1。發酵過程中可同時監測A600和菌體濕重，這2個指標能良好地反映酵母菌的生長情況。酵母的培養溫度一般為28～30℃，本室已先后利用該發酵罐表達了10余種重組蛋白［10－12］，其最佳發酵溫度均在28℃，而本研究對hOSM發酵溫度設置為28℃，同樣取得了理想結果。

本研究除對發酵液pH值、甲醇誘導時間、溫度、甲醇流加速度等主要影響rhOSM發酵產量的因素進行優化之外，還對DO、培養基成分、消泡劑的使用等因素進行了實驗，確定了在使用FM21培養基，轉速為650r·min－1，通入空氣的流量為2vvm，純氧濃度為22%～30% （V／V），罐內壓力為10P，DO值保持在25%左右，發酵后期適當使用消泡劑的條件下，即可維持hOSM工程菌的代謝需要。

據報道，OSM已在大腸桿菌、哺乳動物細胞、重組腺病毒載體［13］中進行表達，其中大腸桿菌中OSM 的表達量為2.3mg·L－1［5］，COS－7細胞中OSM 的表達量約為0.2mg·L－1［6］，其表達量遠遠低于本研究應用的畢赤酵母表達系統，通過40L規模的發酵而獲得的280mg·L－1的產量，是其他表達體系產量的上百倍。這將為rhOSM產業化生產及進一步研究其生物學活性提供充足的物質基礎。

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Fermentation conditions of human oncostatin M expressed inPichiapastorisand analysis of fermentation products

KONG Ning1，GAO Hai－cheng2，LIU Guo－min3，CHEN Yue1，ZHOU Yu－lai1，YAN Wei－qun1
（1.Department of Biomedical Materials，School of Pharmacy，Jilin University，Changchun 130021，China；2.Department of Clinical Pharmacy and Pharmacy Administration，School of Pharmacy，Jilin University，Changchun 130021，China；3.Department of Orthopedics，Second Hospital，Jilin University，Changchun 130021，China）

Objective To optimize the fermentation condition of large scale fermentation of human oncostatin M（hOSM）with engineering strain ofPichiapastoris.Methods The optimal pH condition of hOSM expressed in the methylotrophic yeastPichiapastorisX－33in tube－scale was determined and fermentation of hOSM was performed in an 80Lfermentor in a fed－batch mode for three times.The pH value，culture medium，dissolved oxygen，temperature，methanol feeding speed，initial biomass and etc were focused mainly.hOSM was analyzed by SDS－PAGE.Results In the FM21medium of pH 5.0，when a cell yield of 190g·L－1wet weight was achieved，methanol induction phase began.In the fermentation broth of pH 5.5，the temperature was controlled at 28℃，a stirring speed of up to 650r·min－1，the pressure of fermentor was 10P，dissolved oxygen above 25%and the supply speed of methanol was 9.3mL·h－1·L－1initial fermentation volume，after methanol induction for about 36h，the expression level of hOSM reached 280mg·L－1.Conclusion OSM is successfully obtained through genetic engineering for large scale production of hOSM for following biological functions.

oncostatin M；Pichiapastoris；fermentation

Q78

A

1671－587Ⅹ（2012）05－0943－05

2012－04－10

吉林省衛生廳科研基金資助課題 （3D511AJ83432）

孔 寧 （1979－），女，吉林省吉林市人，講師，醫學博士，主要從事醫學生物工程研究。

顏煒群 （Tel：0431－85619715，E－mail：weiqunyan＠jlu.edu.cn）