黃芪甲苷的抗氧化性對缺氧缺糖H9c2細胞的保護作用探討

承燕，呂磊，江時森

(南京大學醫學院臨床學院，南京軍區南京總醫院心內科，江蘇南京 210002)

黃芪甲苷(AST-Ⅳ)是傳統中藥黃芪的主要成分。有關AST-Ⅳ減輕心肌缺氧作用機制的研究［1-4］均強調其抗氧化能力的重要性。但AST-Ⅳ的抗氧化性在其治療效果中究竟起多大作用還有待進一步研究。本實驗以耗氧劑連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)配制的無糖DMEM溶液處理H9c2細胞作為缺氧模型，以水溶性維生素E(Trolox)作為陽性對照，通過檢測細胞內氧化應激狀態和細胞存活、凋亡、死亡等情況，探索AST-Ⅳ的抗氧化性對缺氧細胞保護的能力。

1 材料與方法

1.1 細胞、藥物與試劑

H9c2細胞(ATCC細胞庫)，高糖 DMEM、無糖DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco公司)，青霉素、鏈霉素(博士德)，Na2S2O4(＞99%，無錫市亞盛化工有限公司)，AST-Ⅳ標準品(＞98%，中國藥品生物制品鑒定所)，RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天)，丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(南京建成生物研究所)，細胞增殖/毒性檢測試劑-8(CCK-8，日本同仁化學研究所)，Trolox、DCFH-DA(Sigma-Aldrich公司);annexin V/PI細胞凋亡試劑盒(Invitrogen)。

1.2 儀器

凈化工作臺(AIRTECH VS-1300)，CO2培養箱(NAPCO 5410)，低溫離心機(eppendorf centrifuge 5417R)，熒光顯微鏡(OLYMPUS IX71-F22FL/PH)，酶標儀(Bio-RAD，Model 680)，紫外可見分光光度計(日立U-3010)，流式細胞儀(BD FACSCalibur)。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 H9c2細胞用含10%胎牛血清、100 U·ml－1青霉素、0.1 mg·ml－1鏈霉素的高糖 DMEM培養液按1×104cm－2接種于培養瓶中，置于37℃、體積分數為5%的CO2飽和濕度培養箱培養。當細胞生長至90%時傳代。

1.3.2 細胞缺糖缺氧模型及藥物處理 當細胞進入對數生長期時，棄培養液，PBS洗滌2遍，換上Na2S2O4無糖 DMEM 溶液(10 mmol·L－1，pH7.2，現配)，37 ℃細胞培養箱內孵育3 h后PBS洗滌2遍，換上完全培養液繼續培養20 h。Na2S2O4溶液孵育3 h后取細胞上清液作血氣分析，氧分壓始終低于15 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。AST-Ⅳ(60 μmol·L－1)和Trolox(50 μmol·L－1)預處理在 Na2S2O4損傷前 1 h 進行，同時藥物處理貫穿整個缺氧、復氧過程。細胞按處理方法不同分為4組:(1)對照組，未作處理;(2)模型組，予缺氧處理;(3)AST-Ⅳ預處理組，缺氧處理前1 h 予以不同濃度(6.7、20、60、400 μmol·L－1)AST-Ⅳ預處理;(4)Trolox預處理組，缺氧處理前1 h予以50 μmol·L－1Trolox 預處理。

1.3.3 細胞勻漿的制備 收集細胞，RIPA裂解液冰上裂解細胞30 min，反復凍融3次后，4℃、12 000×g、離心10 min，收集上清，BCA法測蛋白濃度。

1.3.4 細胞活性檢測 損傷處理后復氧2 h，用CCK-8測細胞活性。該試劑中的WST-8可被細胞中的脫氫酶還原為高度水溶性的黃色甲臜染料，其生成數量與細胞數量成正比。每次實驗每組3個樣本，實驗重復3次。

1.3.5 LDH檢測 根據試劑盒說明測細胞上清和細胞內的 LDH，LDH漏出率 =上清 LDH/總 LDH×100%。每次實驗每組3個樣本，實驗重復3次。

1.3.6 MDA檢測 根據試劑盒說明，用硫代巴比妥酸法測細胞勻漿中的MDA。每次實驗每組3個樣本，實驗重復3次。

1.3.7 細胞內氧自由基(ROS)檢測 當細胞融合度達70%左右進行實驗。

流式細胞儀檢測:損傷處理后收集細胞，用終濃度為 20 μmol·L－1的 DCFH2-DA 溶液(高糖 DMEM 稀釋)重懸并調整細胞濃度為1×106ml－1。37℃細胞培養箱內避光孵育15 min，每5 min顛倒混勻一下。PBS洗滌3次后檢測熒光強度。實驗重復5次。

熒光顯微鏡觀察:損傷處理后用PBS洗滌細胞2次。加入終濃度為 5 μmol·L－1的 DCFH2-DA 溶液，37℃細胞培養箱內避光孵育15 min。用PBS洗滌3次，熒光顯微鏡下觀察。

1.3.8 凋亡檢測 收集細胞，調整細胞濃度至1×106ml－1，冷PBS洗滌后用結合緩沖液重懸，加FITC-annexinⅤ和PI室溫避光染色15 min，流式檢測凋亡情況。左下象限(annexinⅤ－，PI－)代表活細胞，右下象限(annexinⅤ+，PI－)代表早期凋亡細胞，右上象限(annexinⅤ+，PI+)代表死亡細胞。

1.3.9 統計學處理 用SPSS 17軟件進行統計學分析。數據以±s表示，組間差異用單因素方差分析和S-N-K法進行比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 AST-Ⅳ對細胞活力的影響

如圖1所示，經無糖Na2S2O4溶液損傷處理后，細胞存活率顯著下降(P ＜ 0.01)。20 μmol·L－1和60 μmol·L－1的 AST-Ⅳ能明顯改善細胞存活率(P ＜0.01)，但 400 μmol·L－1卻不能。

圖1 不同濃度AST-Ⅳ對Na2S2O4損傷H9c2細胞存活率的影響Fig 1 Effects of different concentrations of AST-Ⅳon survival of H9c2 cells subjected to Na2S2O4

2.2 細胞內的氧化應激情況

與對照組相比，模型組細胞內ROS和MDA的含量顯著增加。當損傷前以 60 μmol·L－1的 AST-Ⅳ或50 μmol·L－1的 Trolox 預處理時，這兩項氧化應激指標能降至接近對照組，兩種藥物效果相近(圖2)。熒光顯微鏡下各組細胞內ROS含量的差異與流式細胞儀檢測結果類似。Trolox預處理組的細胞形態更接近對照組，而AST-Ⅳ預處理組則更偏向于模型組(圖3)。

圖2 AST-Ⅳ或Trolox對Na2S2O4損傷H9c2細胞內ROS和MDA的影響Fig 2 Effects of AST-Ⅳor Trolox on intracellular ROS and MDA production in H9c2 cells subjected to Na2S2O4

圖3 AST-Ⅳ或Trolox對Na2S2O4損傷H9c2細胞內ROS的影響 熒光顯微鏡 ×400Fig 3 Effect of AST-Ⅳor Trolox on intracellular ROS in H9c2 cells subjected to Na2S2O4 microscopy images ×400

2.3 細胞存活率和LDH釋放率

CCK-8的檢測結果(圖4)顯示，模型組的細胞存活率較對照組顯著下降，而經藥物預處理組存活率則較模型組有明顯改善。但AST-Ⅳ預處理組的存活率低于Trolox預處理組。

圖4 AST-Ⅳ或Trolox對Na2S2O4損傷H9c2細胞存活率的影響Fig 4 Effect of AST-Ⅳor Trolox on survival of H9c2 cells subjected to Na2S2O4

LDH主要由壞死細胞釋放入細胞培養液。圖5顯示，模型組LDH釋放率明顯高于對照組。而藥物預處理組LDH釋放率較模型組均有下降，且Trolox預處理組明顯比AST-Ⅳ預處理組下降得多。

圖5 AST-Ⅳ或Trolox對Na2S2O4損傷H9c2細胞LDH釋放率的影響Fig 5 Effect of AST-Ⅳor Trolox on the release of cellular LDH into culture medium of H9c2 cells subjected to Na2S2O4

2.4 細胞凋亡

如圖6所示，FITC-annexin V和PI雙染的流式細胞儀檢測結果顯示，模型組的細胞凋亡率(27.42%)較對照組(1.5%)顯著升高。藥物預處理組的細胞凋亡率較模型組均有下降，且Trolox預處理組(7.36%)比AST-Ⅳ預處理組(17.86%)下降更明顯。

圖6 AST-Ⅳ或Trolox對Na2S2O4損傷H9c2細胞凋亡的影響Fig 6 Effect of AST-Ⅳor Trolox on apoptosis of H9c2 cells subjected to Na2S2O4

3 討 論

AST-Ⅳ是傳統中藥黃芪的一種重要活性成分。隨著提取工藝的完善和成熟，20世紀90年代末人們開始了對AST-Ⅳ這種單體成分的生物學研究。研究所涉范圍甚廣，體現了AST-Ⅳ在循環、免疫、神經、內分泌等系統多方面的保護作用。

2002 年 Li等［5］在 Acta Pharmacol Sin 上發表的AST-Ⅳ對心肌缺血小鼠心臟功能和心肌鈣離子轉運的影響一文揭開了研究AST-Ⅳ對心肌缺血保護作用的序幕，提出AST-Ⅳ減輕心肌細胞內鈣超載是其改善缺血心肌功能的主要機制。Xu等［6］隨后發現，缺氧再復氧后心肌細胞肌漿網Ca2+-ATP酶的表達和活性均下降，而AST-Ⅳ能改善這種情況，支持了AST-Ⅳ能減輕鈣超載的觀點。

與此同時，AST-Ⅳ抗自由基的能力備受關注。一方面，AST-Ⅳ在體外直接清除自由基的能力值得肯定，甚至有人提出，以此特性為標準來鑒定和評價黃芪［7］。另一方面，AST-Ⅳ無論在缺血再灌注的心肌還是在體外缺氧復氧的心肌細胞中均能提高SOD的活力，降低 MDA 的生成。胡炯宇等［1，4］認為，黃芪甲苷在細胞內的抗氧化作用可通過上調SOD的表達和活性來實現。

ROS和Ca2+都是信號傳導中的重要信使，它們不僅相互作用，彼此影響，而且能調節很多信號通路，控制細胞存亡。AST-Ⅳ減輕細胞缺氧損傷的作用主要是通過哪條途徑實現還不能確定［8］。鑒于ROS在細胞病理生理中的重要作用，我們想要探索AST-Ⅳ清除ROS的能力在保護缺氧細胞中能否體現出顯著效果。

我們用無糖Na2S2O4造成缺氧環境。在復氧前，血氣分析顯示缺氧液的氧分壓始終低于15 mmHg。此外，在OH－存在條件下，Na2S2O4溶液可生成超氧陰離子(O·－2)，對細胞造成一定損傷，但O·－2不能通過細胞膜自由擴散。H9c2細胞在10 mmol·L－1的無糖Na2S2O4溶液中孵育3 h后，存活率顯著下降，LDH漏出增加，損傷明顯。

我們采用DCFH2-DA測定細胞內ROS的濃度，并檢測MDA評價細胞脂質過氧化程度，發現60 μmol·L－1的 AST-Ⅳ和 50 μmol·L－1的 Trolox 在此損傷模型中表現出相同的抗氧化能力。DCFH2-DA能自由擴散進入細胞膜和線粒體膜，在細胞內脂肪酶作用下水解成不能自由透過細胞膜的DCFH2，在ROS作用下生成強熒光的DCF，故可檢測細胞內ROS的濃度。MDA為自由基作用于脂質的終產物，反映脂質過氧化程度。

我們又通過 CCK-8檢測細胞存活率、FITC-annexinⅤ/PI染色檢測細胞凋亡率、LDH釋放率觀察細胞壞死情況，結果發現，抗氧化能力相同的AST-Ⅳ和Trolox對損傷細胞的保護作用存在明顯差異，AST-Ⅳ不如 Trolox 有效。60 μmol·L－1的 AST-Ⅳ預處理后，損傷細胞中的ROS和MDA濃度確實有很明顯的下降，體現了AST-Ⅳ抗氧化的作用。AST-Ⅳ對細胞存活的保護效果與Trolox存在顯著性差異，提示:(1)細胞總體的氧化應激狀態并不能準確提示細胞狀態;(2)AST-Ⅳ和Trolox的抗氧化機制可能不同，其差異可能由以下兩方面原因造成，一是在直接清除自由基時，AST-Ⅳ和Trolox所清除的自由基類型和部位不盡相同，二是除直接清除自由基外，AST-Ⅳ參與了其他調控自由基的途徑，如SOD和Ca2+等，而且這些間接途徑可能起著更重要的作用。

另外，實驗中特高濃度的 AST-Ⅳ(400 μmol·L－1)并沒有表現出對缺氧H9c2細胞的保護作用，提示要關注AST-Ⅳ的治療窗。大劑量與小劑量的AST-Ⅳ可能在作用機制上也存在差別。

總而言之，雖然AST-Ⅳ能夠降低無糖Na2S2O4損傷的H9c2細胞的氧化應激，但其抗氧化性在改善細胞存活率以及凋亡、壞死情況上效果有限。AST-Ⅳ在細胞內作用于哪些自由基，對自由基產生的影響等均需要明確。另外，本實驗的結果提示AST-Ⅳ抗氧化之外的作用，它很可能在AST-Ⅳ抗缺氧復氧中起了更重要的作用。一些研究證實其干預了抗氧化之外的信號通路，如對 Ca2+、NF-κB 等的調節［2，9］。這些非抗氧化途徑是否起了主要作用需要進一步明確。

致謝 本實驗中流式細胞儀上機操作由南京軍區南京總醫院中心實驗室研究生周鑫同學完成，特此感謝。

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［6］XU X L，CHEN X J，JI H，et al.Astragaloside Ⅳ improved intracellular calcium handling in hypoxia-reoxygenated cardiomyocytes via the sarcoplasmic reticulum Ca-ATPase［J］.Pharmacology，2008，81(4):325-332.

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［9］楊國富，劉革新，董果雄，等.黃芪甲苷對缺氧/復氧損傷人臍靜脈內皮細胞與中性粒細胞黏附能力及細胞核轉錄因子κb表達的影響［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2008，12(15):2843-2846.