高效液相色譜法測定亞甲基二磷酸含量

趙秀巖，王曉靜，付 博，葉肇云，柳銀黎

（原子高科股份有限公司，北京 102413）

亞甲基二膦酸（MDP）是雙磷酸類藥物，在臨床上主要用于檢查骨骼的血供和代謝方面的病變；經99TcO4－標記后的產品（云克）用作類風濕關節炎、強直性脊柱炎等疾病的治療劑。由于MDP生產過程中會引入一些雜質，這些雜質（特別是亞磷酸）的存在可能會影響藥物臨床用藥的安全有效性，而且其用量也是嚴格控制的，因此MDP原料藥中亞磷酸含量分析是質量控制中的一項重要指標。

MDP屬雙磷酸類藥物，是一種焦磷酸類似物，是將后者的P－O－P連接用P－C－P連接代替。由于其結構中無生色團，極性也較強，因此該類藥物的質量控制一般采用重量分析法［1］、酸堿滴定法［2］、絡合滴定法［3］和分光光度法［4］、柱前或柱后衍生反相高效液相色譜法［5－8］等方法。這幾種分析方法的缺點是特異性較差，其中柱前或柱后衍生法較繁瑣，而且僅能檢測到雙磷類藥物，而不能對其分解產物進行檢測；其他幾種方法的特異性較差。本研究擬采用反相短碳鏈C8色譜柱以減少雙膦酸在柱上的吸附，配以通用型蒸發光散射器代替傳統的紫外檢測器對各相關物質進行檢測，以解決MDP及相關物質的分離及檢測問題。

1 實驗部分

1.1 主要儀器和裝置

液相色譜系統：高效液相色譜儀（美國waters公司）、Alltech2000ES蒸發光散射檢測器（美國奧泰公司）和CSChrom Plus色譜工作站（美國科學系統SSI公司）。

1.2 主要試劑

甲醇（色譜純）、磷酸二氫鈉和亞磷酸：均為國產分析純；MDP 對照品：Toronto Reserch Chemicals Inc提供；正戊胺：純度99%，美國Alfa Aesar產品。

1.3 色譜條件

色譜柱：Symmetry C8色譜柱（150mm×4.6mm，5μm）：Waters公司；流 動相：V （30 mmol／L正戊胺（用乙酸調節pH 5.0））∶V（甲醇）＝98∶2；流速：1mL／min。

蒸發光散射檢測器（ELSD）：漂移管溫度110℃，氣體流量：2.7L／min；撞擊器位置：off，增益：1。在上述條件下，MDP的理論塔板數為2 141，分離度為10.4，拖尾因子0.97。

2 實驗方法

分別將磷酸二氫鈉、亞磷酸、MDP對照品進樣至高效液相色譜系統，采用反相高效液相色譜法分析其MDP含量，確定樣品的保留時間。在相同條件下對MDP原料進行反相高效液相色譜分析。

3 結果與討論

3.1 實驗條件的確定

3.1.1 檢測器的選擇 MDP分子中有二個膦酸基體，極性強，易電離，分子結構中無生色團，因此不能用常規的紫外檢測器或熒光檢測器間接檢測。由于ELSD是通用的質量型檢測器，對檢測室中的各種物質均有響應，它的檢測不依賴于樣品分子中的官能團，因此對于無生色團的磷酸、亞磷酸、MDP等有關物質可同時檢測，避免了衍生對分析的干擾，因此，本工作選用ELSD作為檢測器。

3.1.2 ELSD實驗條件 ELSD的參數選擇主要是霧化氣體的流速和漂移管的溫度。以信噪比為考察指標，考察了漂移管溫度對檢測器靈敏度的影響。結果顯示，溫度過低，流動相揮發不完全、噪音大、雜峰多、信噪比??；溫度過高，部分樣品揮發，且檢測的靈敏度降低。在溫度為110℃時，信噪比最大。因此選擇漂移管溫度為110℃。

霧化器氣體流量對檢測靈敏度的影響：實驗發現，氣體流速過小，流動相揮發不完全、背景噪音大；而流速過高，霧化形成的物質微粒小、散射能力弱、靈敏度降低。當空氣流速為2.7L／min時，樣品的信噪比最大，因此選擇霧化器氣體流量為2.7L／min。

3.1.3 離子對試劑的選擇 離子對反相液相色譜常用四丁基季銨鹽做離子對，但由于四丁基季銨鹽不具有揮發性，因此不能直接應用于ELSD。本實驗采用可揮發的正戊胺做為離子對試劑，結合ELSD檢測器，克服了四丁基季銨鹽離子對流動性與ELSD不相匹配的缺點。

3.2 影響色譜行為的因素

在反相高效液相色譜中，影響物質在色譜柱上保留的主要因素包括流動相的pH、流動相的濃度、流動相中有機溶劑及無機溶劑的比例，通過實驗考察了以上各因素對有關物質色譜峰的影響，并確定實驗的最佳條件。

3.2.1 pH對分離的影響 配制濃度30mol／L的正戊胺溶液，用乙酸調其pH為4～7，甲醇體積含量為2%，考察不同pH對磷酸、亞磷酸及MDP保留值的影響，結果示于圖1。圖1顯示，隨著pH增加，各組分保留值增加。譜峰變寬，當pH為5.0時，譜峰最佳，且滿足分離要求，因此選擇流動相的pH為5.0。

3.2.2 流動相濃度的影響 分別配制濃度為25～40mmol／L正戊胺溶液（用乙酸調節pH至5.0），甲醇體積含量為2%，考察不同流動相濃度對磷酸、亞磷酸及MDP保留值的影響，結果示于圖2。圖2顯示，隨著流動相濃度的增加，各組分的保留值減小，磷酸及亞磷酸分離變差。為保證充分的分離，選用濃度30mol／L的正戊胺溶液。

3.2.3 甲醇含量的影響 甲醇體積含量為0～5%時對各組分的影響結果示于圖3。由圖3可以看出，隨著甲醇體積含量的增加，各組分的保留值減小，為保證各組分的充分分離，選用甲醇體積含量為2%。

3.3 最佳條件下的色譜分析

選用30mmol／L的正戊胺，pH 5.0，甲醇體積含量為2%時，MDP、磷酸及亞磷酸的色譜分離結果示于圖4。由圖4可以看出，MDP與其相關物質在合適的保留時間內達到良好的分離。

圖1 pH對保留值的影響▲——MDP；■——亞磷酸；◆——磷酸

圖2 流動相濃度對保留值的影響▲——MDP；■——亞磷酸；◆——磷酸

圖3 甲醇體積含量對保留值的影響▲——MDP；■——亞磷酸；◆——磷酸

圖4 MDP與相關物質的分離色譜圖1——磷酸；2——亞磷酸；3——MDP

3.4 線性范圍

MDP在600～4 000mg／L范圍內峰面積A的對數值lgA濃度C對數值lgC呈現良好的線性關系，線性回歸方程為：lgA＝1.943 6lgC＋16.212，r＝0.999 6，檢出限為200mg／L。

3.5 精密度與重復性

在優化色譜條件下，取濃度為2.07g／L的MDP對照品溶液，連續進樣6次，MDP峰面積的相對偏差為1.07%。

3.6 回收率

取濃度為920mg／L和299mg／L MDP對照品溶液，按兩點法進樣進行色譜分析，并對分析結果進行線性回歸，另外配制3個已知濃度的MDP對照品溶液，做空白加樣回收，結果列于表1。由表1可以看出，回收率為98%～102%，符合檢測要求。

3.7 樣品測定

采用兩點法進樣，對三批樣品進行測量，結果列于表2。由表2可見，MDP質量含量為95.0%～98.1%，符合檢測要求。

表1 加樣回收率（n＝3）

表2 樣品測量結果（n＝3）

4 結 論

采用反相高效液相色譜法／ELSD測定MDP及有關物質，方法的線性范圍為600～4 000mg／L，r＝0.999 6，檢出限為200mg／L，回收率在98%～102%，適用于MDP原料的質量控制。

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