HPLC法測定豬尿酸酶活性

陳 思，李 輝，馬嬌穎，謝光蓉，陳建華

(中國藥科大學生命科學與技術學院分子生物學教研室，江蘇 南京 210009)

尿酸酶(Uricase，EC 1.7.3.3)是一種以氧作為受體的氧化酶，能夠催化尿酸氧化生成尿囊素、CO2和H2O2。大多數哺乳動物和禽類體內含有尿酸酶，可將核酸組成單位中嘌呤核苷酸代謝的產物尿酸分解成尿囊素，而人和猿類體內缺乏尿酸酶，所以以尿酸形式直接排出體外。尿酸及其鹽類在水中溶解度很低，在某些病理情況下，由于嘌呤代謝紊亂，血液中尿酸積累過多，會導致高尿酸血癥，繼而引發痛風綜合癥。尿酸酶可以將尿酸氧化成尿囊素，從而降低痛風病人體內的尿酸水平，進而消除痛風病人痛風性關節炎、痛風石沉積及尿酸腎結石形成等癥狀[1]。

目前測定尿酸酶活性的方法主要是紫外分光光度法，該方法雖操作方便，但存在檢測線性范圍窄、測量結果易受反應體系雜質的干擾等不足。作者在文獻[2]的基礎上，對其進行改進，建立了HPLC法測定豬尿酸酶粗酶液活性，為尿酸酶活性研究奠定了基礎。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

重組豬尿酸酶基因工程菌，自行構建。

甲醇，色譜純；硼酸、硼砂、高氯酸、磷酸，分析純；尿酸，化學純，美國Fisher Scientific Co.。

高效液相色譜儀，島津；離心機；細胞破碎儀；UV1100型紫外分光光度計；萬分之一天平；pH計；10 kD超濾管，美國Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

硼酸-硼砂緩沖溶液：稱取硼砂4.2908 g、硼酸3.4018 g，定容于500 mL容量瓶中，調pH值至8.4。

終止液：取1 mL 75% 的高氯酸溶液加至10.6 mL去離子水中，終濃度為1 mol·L-1。

尿酸標準溶液：精密稱取0.0168 g尿酸于100 mL容量瓶中，用緩沖溶液定容，終濃度為1 mmol·L-1。

粗酶液：從重組豬尿酸酶工程菌斜面接一環菌苔于50 mL LB培養基中，于37 ℃、200 r·min-1搖床培養至OD值0.4左右，加IPTG(終濃度1 mmol·L-1)誘導6 h后，于12 000 r·min-1離心3 min；將菌體重新懸浮于生理鹽水，離心洗滌3次；將菌體懸浮于硼酸-硼砂緩沖溶液，超聲破壁5 min，于12 000 r·min-1離心10 min，取上清，即得粗酶液。

1.2.2 樣品處理

對照樣品：取750 μL尿酸溶液，加入600 μL終止液，再加入150 μL粗酶液，冰浴5 min，離心(12 000 r·min-1) 2 min，取上清500 μL移至超濾管中于12 000 r·min-1離心10 min，取濾出液20 μL進樣檢測。

檢測樣品：取750 μL尿酸溶液，加入150 μL粗酶液，在37 ℃水浴反應5 min，然后加入600 μL終止液，冰浴5 min，離心(12 000 r·min-1) 2 min，取上清500 μL移至超濾管中于12 000 r·min-1離心10 min，取濾出液20 μL進樣檢測。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax 300SB-C18;流動相：磷酸3 mL，甲醇25 mL，加超純水定容至500 mL，體積比為3∶25∶472，過濾后使用；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：292 nm；柱溫：20 ℃；進樣量：20 μL。

2 結果與討論

2.1 標準曲線的繪制

將1 mmol·L-1的尿酸溶液用緩沖溶液依次稀釋至500 μmol·L-1、400 μmol·L-1、300 μmol·L-1、200 μmol·L-1、100 μmol·L-1、10 μmol·L-1,每個濃度進樣20 μL檢測，記錄峰面積。以尿酸濃度(x)為橫坐標、峰面積(y)為縱坐標繪制標準曲線，如圖1所示。

圖1 HPLC法測得尿酸溶液的標準曲線

由圖1可看出，底物尿酸在10～500 μmol·L-1范圍內線性關系良好。

2.2 方法專屬性

2.2.1 超濾吸附實驗

分別取200 μmol·L-1與300 μmol·L-1尿酸溶液各500 μL，移至超濾管中于12 000 r·min-1離心10 min，取濾出液20 μL進樣檢測，記錄峰面積，與超濾前的尿酸溶液進行比較，計算得到回收率分別為101.80%和99.33%。表明超濾后尿酸濃度只有輕微變化。

2.2.2 緩沖溶液與終止液干擾實驗

取200 μmol·L-1尿酸溶液500 μL，分別加入等體積的雙蒸水、緩沖溶液、終止液，混勻后取20 μL進樣檢測，結果見圖2。

圖2 緩沖溶液與終止液干擾實驗結果

由圖2可看出，緩沖溶液與終止液對檢測結果沒有干擾。

2.2.3 粗酶液干擾實驗

取200 μmol·L-1的尿酸溶液750 μL，依次加入600 μL高氯酸溶液與150 μL粗酶液，混勻后冰浴靜置5 min，取上清500 μL移至超濾管中，于12 000 r·min-1離心10 min，取濾出液20 μL進樣檢測，記錄峰面積；再取200 μmol·L-1尿酸750 μL，加緩沖溶液750 μL，混勻后進樣檢測，記錄峰面積；另設一組空白對照，方法是取750 μL緩沖溶液，加入150 μL粗酶液、600 μL高氯酸溶液，冰浴5 min，取上清500 μL移至超濾管中，于12 000 r·min-1離心10 min，取濾出液20 μL進樣檢測。結果見圖3。

(a)加粗酶液 (b)不加粗酶液 (c)空白對照

由圖3計算可知，回收率為103.98%。表明加入粗酶液的反應體系經高氯酸與超濾處理后，其殘留雜質對檢測結果干擾較小。

2.3 精密度與穩定性

2.3.1 精密度

將300 μmol·L-1的尿酸溶液重復進樣6次，峰面積分別為1 452 821、1 453 349、1 454 144、1 453 528、1 453 182、1 453 194，相對標準偏差(RSD)為0.03%。表明檢測精密度良好。

2.3.2 穩定性

取200 μmol·L-1的尿酸溶液750 μL，依次加入600 μL高氯酸溶液、150 μL粗酶液，混勻后冰浴靜置5 min，于12 000 r·min-1離心5 min，取上清保存一周后進樣檢測，再按同樣方法配制新鮮樣品進樣檢測，結果見圖4。

(a)新鮮樣品 (b)放置一周后樣品

由圖4可計算出，回收率為99.66%。表明樣品穩定性良好。

2.4 與傳統的紫外分光光度法對比

將1 mmol·L-1的尿酸溶液用緩沖溶液依次稀釋為20 μmol·L-1、30 μmol·L-1、40 μmol·L-1、50 μmol·L-1、60 μmol·L-1，每個濃度取3 mL 用紫外分光光度計檢測，記錄292 nm處的OD值。以尿酸濃度(x)為橫坐標、OD值(y)為縱坐標，繪制標準曲線，見圖5。

圖5 紫外分光光度法測得尿酸溶液的標準曲線

取40 μmol·L-1的尿酸溶液2.5 mL加500 μL粗酶液，37 ℃反應5 min，記錄反應前后的OD值，兩種方法所求得的反應初速度見表1。

表1 紫外分光光度法與高效液相色譜法結果對比

由表1可看出，兩種方法檢測結果相近，但是粗酶液中有些雜質會干擾紫外分光光度法的檢測結果，相對而言高效液相色譜法的檢測結果更準確。

2.5 討論

HPLC法測定重組豬尿酸酶基因工程菌發酵液酶活性的主要原理是：利用高氯酸和超濾將反應體系中的大分子除去，以直接檢測底物尿酸的含量，這樣可以避免堵塞進樣器、破壞色譜柱以及干擾檢測結果。之前也有相關文獻報道了HPLC檢測血液尿酸酶活性的方法，其中高氯酸被認為可以除去血清中大部分蛋白質[3]；而Millipore超濾管原本是用作濃縮蛋白和脫鹽的[4]，但也有相關文獻報道它可以用來除去一些大分子[5]，本實驗將這兩種方法相結合除去反應體系中的大分子，而空白對照實驗表明體系內的其它雜質對尿酸檢測沒有影響。

3 結論

建立了一種測定重組豬尿酸酶活性的高效液相色譜方法。結果表明，尿酸在10～500 μmol·L-1范圍內線性關系良好,樣品回收率在99%～104%之間。該方法比紫外分光光度法更精確、具有更廣的線性范圍，且操作簡單、靈敏度高、專屬性好，適于尿酸酶活性的檢測。為進一步研究尿酸酶提供了方法學基礎。

[1] Oda M，Satta Y，Takenaka O，et al.Loss of urate oxidase activity in hominoids and its evolutionary implications[J].Mol Biol Evo，2002，19(5)：640-653.

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[4] 李超,林菊生,陳孝平,等.人肝癌組織α-L-巖藻糖苷酶的提取和鑒定[J].世界華人消化雜志,2005,13(9):1089-1093.

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