多聚二磷酸腺苷（ADP）核糖聚合酶-1（PARP-1）在高糖致大鼠腎臟系膜細胞細胞外基質沉積中的作用

朱恒梅 祝勝郎 陳結慧 葉 玲 蔣 瑩 李向陽

廣東省深圳市第六人民醫院腎內科，廣東 深圳 510082

高血糖作為糖尿病的最基本生化特性,通過多種機制引起糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN），其中氧化應激是一個重要損傷機制。而有研究發現高血糖介導的ROS可以激活多聚 ADP 核糖聚合酶 [poly （ADP-ribose）polymerase，PARP][1]。PARP是一種存在于除酵母外所有真核細胞核內對DNA斷裂敏感的蛋白酶，目前其在DN發病機制中的作用尚未完全闡明。DN時，腎小球系膜細胞是多種致病因子作用的主要靶細胞，主要表現為腎小球的肥大、細胞外基質的堆積、腎小球基底膜的增厚和腎小球濾過屏障功能的異常，其中腎臟細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的蓄積引起的腎小球硬化與間質纖維化是DN發展至終末期腎功能衰竭的主要病理表現[2]。因此本實驗以大鼠腎臟系膜細胞作為研究對象，探討多聚二磷酸腺苷（ADP）核糖聚合酶-1（PARP-1）在高糖致外細胞基質沉積中的作用，以探討PARP在DN發生發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

D-Glucose購自Sigma公司，PJ34購自默克公司；細胞培養用RPMI 1640，胎牛血清購自Gibco公司；Trizol溶液購自美國Invitrogen公司；胰島素購自甘李藥物公司，Trizol Reagent購自Invitrogen公司；細胞裂解液、HRP標記的兔抗大鼠Ⅱ抗、小鼠抗大鼠Ⅱ抗購自Cell signaling公司，小鼠抗大鼠COLⅣ、FN一抗，兔抗大鼠PARP-1一抗購自CHEMICON公司；PARP/Apoptosis檢測試劑盒購自trevigen公司；RevertAidTM FirstStrand cDNA逆轉錄試劑盒購自Fermentas公司，Taq DNA聚合酶購自Takaka公司。其余化學試劑為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組 大鼠腎臟系膜細胞株 （MCs 1097，購自美國ATCC公司）培養于含有15%胎牛血清及0.6 U/mL胰島素的RPMI 1640培養基中。細胞培養至85%融合后，換用無血清培養基培養24 h，后換用新鮮無血清的DMEM低糖（5 mmol/L）培養基，分別加入藥物刺激干預：高糖刺激組中高糖濃度為25 mmol/L，刺激時間為24 h。PJ34干預組先給予3×10-6mol/L PJ34孵育1 h后，加入高糖刺激24 h。單純使用PJ34組作為對照。

1.2.2 細胞總蛋白提取 細胞用PBS清洗后加入細胞裂解液，冰上放置5 min。用細胞刮刮取細胞，收集至1.5 mL Eppendorf管中，放置于冰上。用超聲粉碎儀在冰上進行超聲粉碎，500 W、1 s×15次，以剪切 DNA，降低黏稠度。4℃，12000 r/min離心10 min，留取上清。取10 μL上清測定濃度，余儲存于-80℃備用。細胞總蛋白提取物做Western blot分析高糖對于大鼠腎臟系膜細胞PARP-1表達的影響。

1.2.3 RT-PCR大鼠腎臟系膜細胞總RNA的提取按照Trizol說明書操作。RT-PCR引物購自美國INVITROGEN公司上海分部。逆轉錄反應及RT-PCR反應：取1.0 μg的總RNA采用 RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit，以 Oligo（dT）18為引物合成第一鏈cDNA（按試劑盒說明書進行）；②PCR：采用Takaka公司試劑盒 PCR反應擴增。引物序列見表1。產物儲存于-20℃。取8 μL PCR產物在含有0.5 μg/mL溴化乙錠（EB）的1.5%瓊脂糖凝膠中以85 V恒壓電泳30 min，紫外檢測儀上觀察，用凝膠圖像成像系統成像及進行掃描定量分析DNA帶的含量，以所測得積分吸光度與內參照β-actin積分吸光度的比值代表半定量值。PARP-1、COLⅣ、FN、β-actin引物序列及反應條件見表1。

1.2.4 PARP活性檢測 細胞 PARP活性檢測按照 PARP/Apoptosis檢測試劑盒（trevigen公司）說明書進行。

1.3 統計學方法

采用SPSS 13.0進行統計分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，各組數據之間差異顯著性用多個樣本均數比較及ANOVA方差分析檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 PCR引物合成序列

2 結果

2.1 PJ34抑制高糖誘導大鼠腎臟系膜細胞PARP-1的過表達

應用高糖刺激大鼠腎臟系膜細胞，高糖組系膜細胞PARP-1 mRNA和蛋白的表達較較低糖對照組明顯增加，分別較低糖對照組增加72.3%和68.4%（P＜0.05），PJ34組系膜細胞PARP-1 mRNA和蛋白的表達分別減少為高糖組的31.8% 和 55.5%（P＜0.05）。見圖1～4。單純使用PJ34不影響系膜細胞PARP-1的表達。同時，高糖顯著誘導大鼠腎臟系膜細胞PARP-1激活，高糖組為低糖對照組活性的1.77倍（P＜0.05），給予PJ34預處理可顯著抑制高糖誘導的PARP激活，活性降低為高糖組的67.8% （P＜0.05）。見圖5。

2.2 PJ34抑制高糖誘導大鼠腎臟系膜細胞FN及COLⅣ的過表達

應用高糖刺激大鼠腎臟系膜細胞，高糖組系膜細胞COLⅣ和FN mRNA的表達較低糖對照組分別增加57.9%和54.5%（P＜0.05），PJ34顯著抑制高糖所致系膜細胞COLⅣ和FN mRNA的表達，分別減少為高糖組的68.2%和54.7%（P＜0.05）。見圖6、7。單純使用PJ34不影響系膜細胞COLⅣ和FN mRNA的表達。同時，高糖組系膜細胞COLⅣ和FN蛋白的表達較低糖對照組分別增加51.2%和36.9%（P＜0.05），PJ34組系膜細胞COLⅣ和FN蛋白的表達分別減少為高糖組的54.0%和66.6%（P＜0.05）。見圖8、9。單純使用PJ34不影響系膜細胞COLⅣ和FN的表達。

3 討論

糖尿病腎病（DN）是糖尿病嚴重的并發癥之一，也是發達國家終末期腎病的首要原因，我國近年來發病率也有不斷上升的趨勢。高血糖作為糖尿病的最基本生化特性，通過多種機制引起DN，其中氧化應激是一個重要損傷機制。血糖通過多種機制引起DN，其中代謝途徑、糖基化終產物（AGEs）途徑、蛋白激酶C途徑以及己糖胺途徑是公認的四個重要損傷機制[3]。DN研究表明，PARP和蛋白非酶糖基化、ROS生成異常、鈣代謝紊亂密切相關，PARP和糖尿病并發癥之間關聯的研究進展成為人們關注的熱點。

圖1 高糖組（25 mmol/L）誘導PARP-1mRNA表達及PJ34的干預作用

圖2 高糖組（25 mmol/L）誘導PARP-1 mRNA表達及PJ34的干預作用的統計圖（n=3）

圖3 高糖組（25 mmol/L）誘導PARP-1蛋白表達及PJ34的干預作用

圖4 高糖組（25 mmol/L）誘導PARP-1蛋白表達及PJ34的干預作用的統計圖（n=3）

圖5 高糖組（25 mmol/L）誘導PARP-1活性表達及PJ34的干預作用的統計圖（n=3）

圖6 高糖組（25 mmol/L）誘導COLⅣ和FN mRNA的表達及PJ34的干預作用

圖7 高糖組（25 mmol/L）誘導COLⅣ和FN mRNA的表達及PJ34的干預作用的統計圖（n=3）

PARP是一類存在于多數真核細胞中的蛋白質翻譯后修飾酶。主要存在于細胞核內，少量存在于細胞漿內。它是能選擇性識別并結合DNA缺口的DNA結合蛋白酶，主要通過修復DNA單鏈及雙鏈斷裂在維持基因組的完整性方面發揮作用[4]。在糖尿病時，增高的細胞內葡萄糖水平引起ROS大量釋放，DNA鏈嚴重損傷，以致PARP過度激活，而消耗大量NAD+及ATP，引起細胞能量供應不足而壞死或凋亡，同時，NAD+及ATP的大量耗竭引起細胞抗氧化能力的嚴重削弱，引起氧化應激損傷和Ca2+內流的增加，導致細胞損傷。另外，PARP調控了轉錄因子的活性，活化的PARP上調了大量因子的表達（TNF-α、一氧化氮合酶、內皮素等），共同介導DN的發生。然而更為重要的是，PARP催化生成 ADPR，使GAPDH活性大大降低，因而激活上述四個重要損傷途徑。因此，可以想象PARP在DN的發生發展中起著關鍵作用。只要能特異地、完全地抑制PARP的過度表達，就可以抑制其下游的所有的病理損傷過程，阻斷高血糖對糖尿病腎組織細胞的損害，逆轉DN的全過程。

圖8 高糖組（25 mmol/L）誘導COLⅣ和FN蛋白表達及PJ34的干預作用

圖9 高糖組（25 mmol/L）誘導COLⅣ和FN蛋白表達及PJ34的干預作用的統計圖（n=3）

ECM是細胞外大分子構成的網絡，主要包括膠原（collagen，COL）， 層粘連蛋白 （laminin，LN）， 纖維連接蛋白（fibronectin，FN）等，它的過度堆積或降解減少均視為病理性重塑，是腎臟病變發生，發展的主要原因。在本研究中，筆者發現高糖刺激可以引起大鼠系膜細胞細胞內PARP激活，PARP-1表達升高，FN、COLⅣ蛋白和mRNA表達增加。再次證實了異常增高的高糖可導致腎臟系膜細胞分泌細胞外基質，引起細胞外基質的沉積。在此過程中，筆者同時觀察到PARP-1基因及蛋白表達的增高，提示PARP-1可能參與了高糖引起的腎小球細胞外基質的沉積。筆者還發現應用PARP抑制劑PJ34干預后大鼠系膜細胞PARP-1表達降低，明顯改善了高糖誘導的細胞外基質FN、COLⅣ蛋白和mRNA表達增加。PJ34是一種新研制的選擇性PARP-1抑制劑，通過競爭性阻斷PARP分子上NAD+結合位點而發揮作用，它的抑酶活性比以往的PARP抑制劑都強，是3-AB的1萬倍[5]。PJ34 的分子式為 C17H17N3O2·HCl，屬于菲啶酮類化合物，呈水溶性，口服和注射方式的生物利用度都高[6]。筆者的研究中運用PJ34干預處理后發現在抑制PARP-1表達的同時高糖誘導的指示細胞外基質沉積的指標也被顯著抑制了，進一步提示PARP-1參與了高糖引起的腎小球細胞外基質的沉積。

既往有很多實驗也證實了抑制PARP-1活性可以改善高糖或者糖尿病所致的一系列病理結局。Choi等[7]發現PARP特異性抑制劑可以改善糖尿病小鼠冠狀動脈功能。同樣，有研究表明抑制PARP活性可以中和糖尿病小鼠的腎小球肥大及外周神經病變[8]。在糖尿病神經病變及視網膜病變的諸多研究中也觀察到抑制PARP可以改善上述病變[9-10]。筆者既往也發現抑制PARP可以顯著改善高糖所致腹膜間皮細胞的轉分化及纖維化[11]。對于糖尿病腎病，Szabo等[12]也發現在db/db糖尿病小鼠中，腎組織PARP活性增加，其特異性抑制劑可以減少小鼠尿蛋白、小球系膜增寬及足突細胞損傷。另外，其特異性抑制劑還可以抑制高糖刺激的體外培養的足突細胞的凋亡。筆者既往的研究也發現在下調PARP-1活性及表達能部分逆轉高糖誘導的大鼠腎臟系膜細胞細胞外基質積聚[13]。因此，研究和開發PARP抑制劑，將為臨床治療氧化應激相關性疾病提供新策略和新方法，為DN的治療提供一個新的思路。

[1]Luo X，Kraus WL.On PAR with PARP：cellular stress signaling through poly（ADP-ribose）and PARP-1[J].Genes Dev，2012，26（5）：417-432.

[2]Chang SY，Chen YW，Chenier I，et al.Angiotensin II type II receptor deficiency accelerates the development of nephropathy in type I diabetes via oxidative stress and ACE2[J].Exp Diabetes Res，2011：521-576.

[3]Rolo，Anabela P，Carlos M.Diabetes and mitochondrial function： Role of hyperglycemia and oxidative stress[J].Toxicology and Applied Pharmacology，2006，212：167-178.

[4]Javle M，Curtin NJ.The role of PARP in DNA repair and its therapeutic exploitation[J].Br J Cancer，2011，105（8）：1114-1122.

[5]Suarez WL，Mabley JG，Power R，et al.Poly （ADP-ribose） polymerase inhibition prevents spontaneous and recurrent autoimmune diabetesinNOD mice by inducing apoptosis of islet-infiltrating leukocytes[J].Diabetes，2003，52（7）：1683-1688.

[6]Wang S，Wang H，Davis BC，et al.PARP1 inhibitors attenuate AKT phosphorylationvia the upregulation of PHLPP1[J].Biochem Biophys Res Commun，2011，412（2）：379-384.

[7]Choi SK，Galán M，Kassan M，et al.Poly （ADP-Ribose） polymerase 1 inhibition improves coronary arteriole function in type 2 diabetes mellitus[J].Hypertension，2012，59（5）：1060-1068.

[8]Drel VR，Pacher P，Stavniichuk R，et al.Poly （ADP-ribose） polymerase inhibition counteracts renal hypertrophy and multiple manifestations of peripheral neuropathy in diabetic Akita mice[J].Int J Mol Med，2011，28（4）：629-635.

[9]Xu B，Chiu J，Feng B，et al.PARP activation and the alteration of vasoactive factors and extracellular matrix protein in retina and kidney in diabetes[J].Diabetes Metab Res Rev，2008，24（5）：404-412.

[10]Negi G，Kumar A，Sharma SS.Concurrent targeting of nitrosative stress-PARP pathway corrects functional，behavioral and biochemical deficits in experimental diabetic neuropathy [J].Biochem Biophys Res Commun，2010 ，391（1）：102-106.

[11]Lei P，Jiang Z，Zhu H，et al.Poly （ADP-ribose） polymerase-1 in high glucose-induced epithelial-mesenchymal transition during peritoneal fibrosis[J].Int J Mol Med，2012，29（3）：472-478.

[12]Szabó CC，Biser AA，Benko RR，et al.Poly （ADP-ribose） polymerase inhibitors ameliorate nephropathy of type 2 diabetic Leprdb/db mice[J].Diabetes，2006，55（11）：3004-3012.

[13]Zhu H，Jiang Z，Lei P，et al.Role of Poly （ADP-ribose） Polymerase-1 activation in angiotensin II–induced extracellular matrix accumulation in rat mesangial cells[J].Kidney Blood Press Res，2011，34（5）：320-327.