烏司他丁對膿毒癥急性肺損傷大鼠熱休克蛋白70表達的影響

王 俏 朱 虹 沈 策▲

1.上海交通大學醫學院附屬第六人民醫院呼吸內科，上海 200233；

2.上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院急診科，上海 200011

膿毒癥是一種感染引起的全身性炎癥反應綜合征，肺是常累及的靶器官，常并發急性肺損傷（ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）[1]。 其中，ALI的發病急，死亡率高，是危重病治療的難點之一。烏司他丁（Ulinastatin，UTI）是從健康成年男性尿中分離純化的尿胰蛋白酶抑制劑[2]。研究表明，UTI除對多種蛋白酶、糖脂水解酶具有抑制作用外，還具有抑制多種炎癥介質釋放等作用。基礎及臨床初步研究提示，UTI具有減輕肺損傷，緩解呼吸衰竭等作用，但是其具體作用機制仍不明確。熱休克蛋白（HSP）是一類細胞在受熱、生物應激、理化因素等刺激后產生的在進化上高度保守的伴隨細胞蛋白，可以增強細胞的應激能力，保護細胞損傷的發生和發展[3]。本實驗旨在觀察UTI對膿毒癥ALI大鼠肺組織HSP70表達的影響，研究UTI對膿毒癥ALI大鼠的肺保護作用，探討可能的作用機制，為臨床膿毒癥肺損傷的治療提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性Wistar大鼠39只，體重200～250 g，購自中國科學院上海實驗動物中心。

1.2 實驗藥品

烏司他?。║linastatin，UTI）50000 U/支，廣東天普生化醫藥股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物模型的制備與分組 39只Wistar大鼠，分為3組：假手術（sham）組 9 只，ALI組 15 只，烏司他?。║TI）組 15只。本實驗參照文獻[4]的方法，以大鼠盲腸結扎穿孔術（CLP）復制膿毒癥模型。以2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后固定，腹正中切開1.5 cm長的切口，在盲腸根部結扎，用18號針在游離端穿通2次，輕擠出少量腸內容物，留置2 cm皮瓣防止針孔閉合，送回盲腸于腹腔，縫合切口，術畢皮下注射生理鹽水30 mL/kg抗休克。UTI組于造模前30 min腹腔注射UTI（20000 U/kg），ALI組于造模前30 min腹腔注射生理鹽水2 mL。在假手術后6、12、24 h這3個時間點sham組分別處死大鼠3只，ALI組和UTI組分別處死大鼠5只。

1.3.2 標本的制備 分別于各時間點取抗凝腹主動脈血0.5 mL，行動脈血氣分析，測定大鼠動脈血氧分壓（PaO2），取每只大鼠左肺上葉測定肺組織濕/干重比值（W/D），取右下肺組織置于-80℃保存，用于測定肺組織中的HSP70 mRNA含量。另取左肺下葉置于10%中性甲醛溶液中固定，制成病理切片，采用蘇木精-伊紅（HE）染色。

1.3.3 實時熒光定量PCR（realtime-PCR）檢測肺組織HSP70 mRNA含量 取肺組織50 mg，按Trizol法常規提取細胞總RNA并反轉錄合成cDNA，進行實時PCR擴增（Stratagene M×3000實時熒光定量PCR儀）。HSP70引物序列：上游 5′-GCA CCA GCA GCC ATC AAG AGT-3′，下游 5′-GTG TGC AAG CCG ATC ATC AGC-3′，擴增產物為 180 bp。 HSP70 實時 PCR 條件：95℃ 3 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s，共32個循環。所有待檢標本每組設3個平行孔，各重復3次。標準化HSP70基因的表達量為各標本HSP70基因CT值與相應內參基因β-actin CT值的差值。

1.4 統計學方法

應用SPSS 11.0軟件包分析，計量資料數據以均數±標準差（）表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。 以 P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 動脈血氣分析變化

ALI組大鼠動脈血氧分壓（PaO2）隨CLP術后時間的延長而降低，與sham組比較，顯著降低（P<0.05），UTI組PaO2各時間點較ALI組明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 各組大鼠動脈血氣分析PaO2結果比較（mm Hg，）

表1 各組大鼠動脈血氣分析PaO2結果比較（mm Hg，）

注：與sham組比較，*P<0.05；與ALI組比較，#P<0.05

組別 只數 術后6 h 術后12 h 術后24 h sham組ALI組UTI組35596.3±2.0579.8±3.18*86.5±2.34*#91.5±3.2872.3±4.02*81.0±3.31*#93.7±2.4361.3±3.19*76.5±2.27*#

2.2 肺組織濕/干重比值（W/D）比值變化

ALI組大鼠W/D比值隨CLP術后時間的延長而上升，較sham組顯著升高（P<0.01），UTI組治療后W/D比值明顯低于ALI組同時間點，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

表2 各組大鼠肺組織濕/干重（W/D）比值比較（）

表2 各組大鼠肺組織濕/干重（W/D）比值比較（）

注：與sham組比較，*P<0.05；與ALI組比較，#P<0.05

組別 只數 術后6 h 術后12 h 術后24 h sham組ALI組UTI組3554.037±0.0605.788±0.180*4.668±0.240*#4.138±0.2506.663±0.230*5.312±0.310*#4.241±0.4307.330±0.320*6.492±0.280*#

2.3 肺組織的病理形態學變化

sham組大鼠肺組織結構完整，肺泡腔清晰，肺間質無水腫、無炎癥，且各時間點無明顯差異。ALI組大鼠造模后6 h可見肺泡內水腫滲出，伴有出血及炎癥細胞浸潤，隨時間的延長病變程度加重，至造模后24 h可見肺泡隔增寬，肺泡內嚴重的充血、出血及肺間質見大量炎性細胞浸潤。UTI組大鼠肺組織病理變化較ALI組輕，造模后6 h可見部分肺泡內少量水腫滲出伴有少量出血，至造模后24 h可見大鼠肺泡隔略有增寬，部分肺泡內見滲出、水腫、出血，肺間質見少量炎癥細胞浸潤，見圖1。

2.4 肺組織HSP70 mRNA的表達

ALI組大鼠肺組織HSP70 mRNA的表達水平隨著CLP術后時間的延長顯著升高（P<0.05），至CLP術后12 h達到高峰。UTI組大鼠各時間點肺組織HSP70 mRNA的表達水平又顯著高于ALI組（P<0.05）。見表3。

表3 各組大鼠肺組織中HSP70 mRNA表達相對密度值比較（）

表3 各組大鼠肺組織中HSP70 mRNA表達相對密度值比較（）

注：與sham組比較，*P<0.05；與ALI組比較，#P<0.05

組別 只數 術后6 h 術后12 h 術后24 h sham組ALI組UTI組3550.623±0.0300.827±0.090*1.015±0.040*#0.582±0.0501.316±0.150*1.623±0.030*#0.533±0.1401.142±0.040*1.431±0.090*#

3 討論

膿毒癥常見的并發癥為ALI，其病理特征是肺泡毛細血管內皮細胞和肺泡上皮細胞損傷，中性粒細胞在肺內聚集，表現為廣泛的肺水腫和微小肺不張，臨床上表現低氧血癥[5]。本實驗采用較經典的盲腸結扎穿孔（CLP）制作大鼠膿毒癥性ALI模型。實驗研究發現，ALI組大鼠動脈血氧分壓（PaO2）隨著時間的延長而下降明顯，W/D比值隨著時間的延長而增高。同時光鏡下觀察發現，ALI組大鼠造模后6 h可見肺泡內水腫滲出，伴有出血及炎癥細胞浸潤，隨時間的延長病變程度加重，至造模后24 h可見肺泡隔增寬，肺泡內嚴重的充血、出血及肺間質見大量炎癥細胞浸潤。

HSP是一具有多個成員的蛋白質家族，根據分子量的大小可以分為多個亞家族，其主要功能與蛋白質代謝有關。在各種應激反應中防止蛋白質變性、聚集，對細胞具有保護作用。其中HSP70與肺臟生物學關系較為密切，是HSP中最保守的一族，在細胞應激后生成最為顯著，提高機體組織對各種應激損傷的耐受性。HSP70主要是作為分子伴侶，參與蛋白質的折疊、組裝和轉運，清除細胞內變性的蛋白質，穩定細胞結構[6]。有研究發現，膿毒癥大鼠進行呼吸機正壓通氣導致機械張力可誘導肺組織HSP70的表達增加，改善肺損傷[7]。將載有HSP70的腺病毒基因注入動物體內可緩解ARDS的進展[8]。HSP70可能通過多種機制防止肺損傷的發生和發展：①抗炎癥，使炎癥介質的產生減少，抗炎細胞因子的表達增加；②抗氧化，可抑制氧陰離子的生成，直接或間接地促進釋放自身的抗氧化酶，提高抗氧化酶類的活性；③調節細胞內蛋白的修復與合成，減輕應激或損傷刺激引起的細胞膜蛋白的變性，保護細胞蛋白質rRNA及DNA的合成途徑免受損傷；④抗細胞凋亡，上調細胞內Bcl-2的表達[9-10]。本實驗結果顯示，ALI組大鼠各時間點肺組織HSP70 mRNA表達水平較sham組顯著升高，至CLP術后12 h達到高峰，后開始下降。

UTI是一種廣譜的蛋白水解酶抑制劑，對多種蛋白酶、糖和脂水解酶有抑制作用，具有抑制過度的炎癥反應、改善休克時組織循環與器官灌注、對溶酶體酶具有穩定作用。UTI在過度炎癥反應、缺血和缺氧等造成的心、肺、肝、腎等組織細胞損害中具有保護作用。有研究表明，UTI可作用于ALI的早期環節，在轉錄水平通過P38MARK信號通路抑制TNF-α，改善促炎性介質/抗炎性介質失衡狀態，減輕LPS誘導的ALI[11]。另外，UTI可以抑制肺泡內皮細胞表面蛋白質的分解，減小肺毛細血管的通透性[12]。臨床上運用UTI治療ALI/ARDS綜合征患者，可以改善患者通氣功能，減輕肺水腫，顯著緩解患者的缺氧狀態，減少多臟器功能衰竭的發生[13]。本實驗結果顯示，應用UTI治療后，UTI組大鼠各時間點PaO2較ALI組上升，增高的W/D比值下降，HSP70 mRNA表達顯著增加，同時肺組織病理形態學表現均有明顯改善。提示UTI可能通過上調HSP70的表達，改善膿毒癥大鼠肺組織的損傷。

綜上所述，運用UTI治療膿毒癥ALI后可能通過損傷保護因子HSP70表達的上調，從而減輕了肺組織病理損傷，對ALI有保護作用。這可能是UTI治療膿毒癥ALI有效的機制之一，但其確切的機制還需要進一步深入實驗研究。

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