新型鉀通道開(kāi)放劑(QO-58)在大鼠體內(nèi)組織分布研究

劉燦仿，祁金龍，張海林，賈慶忠

(1.河北醫(yī)科大學(xué)藥理教研室，教育部血管與神經(jīng)生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北省新藥藥理毒理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊 050017;2.邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校藥劑教研室，河北邢臺(tái) 054000)

QO-58為吡唑并［1，5-a］嘧啶酮類(lèi)化合物，其結(jié)構(gòu)比較新穎，生物活性較高，是經(jīng)過(guò)高通量篩選發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新型的鉀通道開(kāi)放劑，對(duì)電壓依賴(lài)性M-通道(KNQ2/3通道)有良好開(kāi)放活性，M-通道主要分布于神經(jīng)系統(tǒng)，并且在神經(jīng)細(xì)胞興奮的閾電位附近開(kāi)放，對(duì)調(diào)節(jié)神經(jīng)興奮性起重要作用。細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)結(jié)果顯示 QO-58開(kāi)放 KNQ2/3通道的 EC50為0.21 μmol·L－1，與國(guó)外上市的 Retigabine(EC501.89 μmol·L－1)比較生物活性更強(qiáng)。前期藥效學(xué)試驗(yàn)證實(shí)該物質(zhì)對(duì)戊四唑誘發(fā)的小鼠癲癇和電刺激引發(fā)的驚厥有較好的作用，對(duì)緩激肽誘導(dǎo)的炎性疼痛也有效［1］。

藥物在體內(nèi)的分布與藥理作用密切相關(guān)，藥物只有進(jìn)入靶器官并達(dá)到一定濃度才能發(fā)揮藥效，而進(jìn)入其他器官則無(wú)藥理作用或產(chǎn)生不良反應(yīng)。影響藥物分布的因素很多，主要包括:體內(nèi)循環(huán)與血管通透性，藥物與血漿蛋白結(jié)合能力，藥物的理化性質(zhì)與透過(guò)生物膜的能力，藥物與組織的親和力等。因此，了解藥物在組織中的分布情況，對(duì)新藥的研發(fā)有著重要意義。

QO-58化合物我們已經(jīng)申請(qǐng)了專(zhuān)利保護(hù)，目前缺少關(guān)于該物質(zhì)藥代動(dòng)力學(xué)和組織分布的研究資料，為了進(jìn)一步弄清楚該物質(zhì)在體內(nèi)的吸收、分布規(guī)律，我們通過(guò)RP-HPLC方法觀察了在大鼠體內(nèi)的組織分布特征，以闡明QO-58在大鼠體內(nèi)的變化規(guī)律，為進(jìn)一步的新藥研究與開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)［4］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器和器材 島津LC-20AT高效液相色譜儀，島津LC-solution色譜工作站;HGC-24A型氮?dú)獯蹈蓛x(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司);Eppendorf centrifuge 5417R型高速離心機(jī);Ke-400kDB型高功率數(shù)控超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司);Eppendorf centrifuge5810R大型離心機(jī);D-78532 Tuttlingen型旋渦混合器;Heidolph DIAX 100型電動(dòng)勻漿機(jī)等。

1.1.2 主要試劑 QO-58結(jié)晶高純品:由河北醫(yī)科大學(xué)新藥研發(fā)中心提供(批號(hào):2010003)，純度為98.5%;乙腈和甲醇:色譜純，德國(guó) Merck(Honeywell)公司提供;N，N-二甲基乙酰胺為色譜純，購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;聚氧乙烯蓖麻油為注射級(jí)(Cremophor ELP)，由河北醫(yī)科大學(xué)藥廠提供;尼群地平標(biāo)準(zhǔn)品:中國(guó)藥品生物制品鑒定所提供(批號(hào):100585-200602);乙酸銨:天津市化學(xué)試劑一廠提供。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年的清潔級(jí)SD大鼠共24只，♀♂各半，體質(zhì)量220～250 g，購(gòu)于河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào):110305。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。

1.2 方法

1.2.1 灌胃用 QO-58溶液 取 QO-58原料藥適量，用適量溶劑(N，N-二甲基乙酰胺:聚氧乙烯蓖麻油=1∶9)溶解，得到備用溶液。

1.2.2 色譜條件 色譜柱:Shim-pack VP-ODS C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，Shim-Pack VP-ODS 保護(hù)柱;流動(dòng)相:乙腈 －0.2 mol·L－1乙酸銨(45 ∶55)，流速為1 ml·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng) 285 nm;柱溫:35℃;進(jìn)樣量:20 μl。

1.2.3 給藥與組織樣品采集 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室所做的QO-58藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和《化學(xué)藥物非臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》規(guī)定，確定大鼠組織分布實(shí)驗(yàn)在吸收相、分布相和消除相的取樣時(shí)間分別為2、7、18、36 h，將24只大鼠隨機(jī)分成4組，每組6只，確定組織分布采用的劑量均為50 mg·kg－1。于上述各時(shí)間點(diǎn)斷頭放血后處死6只大鼠，迅速取出心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、腦、肌肉、脂肪、睪丸、子宮，取到的樣本必須有一致性和代表性，用生理鹽水沖去其表面血污，再用濾紙吸干表面的浮血，稱(chēng)重，置于－80℃冰箱保存待用［2］。

1.2.4 組織樣品處理和分析 各組織均稱(chēng)取實(shí)際重量，按1∶2的比例加乙腈適量，將組織勻漿，勻漿4 000 r·min－1離心 10 min，取上清 200 μl，加入乙腈 600 μl，渦旋混勻，12 000 r·min－1離心 10 min，取上清液700 μl室溫氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?00 μl乙腈溶解，超聲處理 5 min，12 000 r·min－1離心 10 min，取上清20 μl進(jìn)樣分析。結(jié)果代入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得各組織樣品濃度。

2 結(jié)果

2.1 方法的專(zhuān)屬性 取大鼠空白組織，不加內(nèi)標(biāo)溶液，按照“1.2.4”方法處理并分析，獲得空白樣品的色譜圖;將規(guī)定濃度的QO-58標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液加入大鼠空白組織，同法操作，獲得相應(yīng)的色譜圖;同法得到大鼠給藥后組織樣品色譜。通過(guò)對(duì)方法的專(zhuān)屬性考察，結(jié)果顯示各組織中的雜質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)干擾，QO-58與內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間分別為11 min、13 min，兩者峰形良好，分離度符合要求，肝臟典型色譜圖見(jiàn)Fig 1。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 精密量取 QO-58(500 mg·L－1)貯備液不同體積和內(nèi)標(biāo)溶液(220 mg·L－1)30 μl至EP塑料小管中，氮?dú)獯蹈?，加入空白組織200 μl混勻配制成 QO-58濃度為0.05～80 mg·L－1的系列濃度組織樣品，每條標(biāo)準(zhǔn)曲線8個(gè)濃度，每個(gè)濃度平行處理樣品5份，按照前述的樣品處理及測(cè)定方法進(jìn)行檢測(cè)。以空白組織中藥物的濃度(C)為橫坐標(biāo)X，藥物和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值(A)為縱坐標(biāo)Y，以加權(quán)最小二乘法回歸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［5］。

Fig 1 Chromatograms of QO-58 in rat liver

在0.05 ～80 mg·L－1范圍內(nèi)，QO-58 在大鼠各組織中的濃度與QO-58和內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積比線性關(guān)系良好，r值均大于0.9948。

2.3 最低定量限(LOQ)QO-58的檢測(cè)限、定量限是在信噪比為S/N=3、S/N=10的基礎(chǔ)上確定的，該方法的定量限為0.025 mg·L－1，檢測(cè)限為0.01 mg·L－1。

2.4 精密度和準(zhǔn)確度 按照前面組織處理方法制備成低、中、高(0.05、0.4、3.2 mg·L－1或 0.5、5、80 mg·L－1)3種濃度的QO-58的QC組織，平行操作5份，于同1天內(nèi)測(cè)定3次，計(jì)算日內(nèi)精密度。連續(xù)測(cè)定3 d，每天制備并根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定，計(jì)算日間精密度。各組織日內(nèi)精密度RSD為2.15%～10.03%，日間精密度RSD為3.64% ～14.13%，符合要求［3］。

2.5 提取回收率實(shí)驗(yàn) 按照前面組織樣品處理方法制備QO-58在組織樣品中的高、中、低3個(gè)濃度的質(zhì)量控制樣品，以提取處理后的樣品色譜峰面積與相應(yīng)濃度的未經(jīng)提取的樣品直接進(jìn)樣獲得的色譜峰面積之比，考察組織樣品的提取回收率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示回收率為94.27% ～108.08%，其相對(duì)偏差均小于10% ，說(shuō)明該提取方法符合要求。

2.6 穩(wěn)定性 按照前面組織樣品處理方法制備成低、中、高3種濃度的QO-58的QC組織樣品各3份，測(cè)定濃度的平均值，分別考察在室溫放置2 h和4℃放置1周，－20℃放置18 d及3次凍融循環(huán)處理后在室溫條件下的穩(wěn)定性。

結(jié)果表明:經(jīng)處理的模擬組織樣品在室溫放置2 h，－20℃冰箱中保存18 d，凍融經(jīng)過(guò)3次循環(huán);偏差都小于10%，樣品在上述條件下均基本穩(wěn)定［6］。

2.7 QO-58在大鼠體內(nèi)組織分布 2 h時(shí)肝臟QO-58濃度最高，其次為血漿、胃、腸、腎、肺，濃度比較低的是心、脂肪、睪丸、腦等組織。7 h時(shí)胃中QO-58濃度最高，其次為肝臟、血漿、肺、腎、腸，濃度比較低的是肌肉、脂肪、腦等組織。18 h時(shí)肝臟中QO-58濃度最高，其次為血漿、腎、肺、胃、腸，濃度比較低是是肌肉、脂肪、腦等組織。36 h時(shí)各組織基本已經(jīng)檢測(cè)不到QO-58，結(jié)果見(jiàn)Fig 2。

Fig 2 Concentration of QO-58 tissues and plasma after oral administration of 50 mg·kg-1QO-58 to rats(n=6)

3 討論

觀察大鼠QO-58灌胃后組織分布結(jié)果，從各組織中藥物濃度變化的時(shí)程看，含量呈動(dòng)態(tài)分布，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，各組織中藥物含量也發(fā)生相應(yīng)的變化。小腸的濃度在第1個(gè)觀察點(diǎn)(2 h)最高，除給藥方式的原因外，亦說(shuō)明QO-58對(duì)小腸有特殊的親和力。QO-58在各組織分布的時(shí)程變化與在血漿中藥物濃度變化過(guò)程基本一致，提示沒(méi)有明顯的再分布現(xiàn)象［7］。

給藥后2～7 h時(shí)胃中均保持一較高藥物濃度，這可能是由于胃是給藥部位，藥物可經(jīng)胃吸收。而7 h胃中藥物濃度高于2 h胃中藥物濃度是由于灌胃所用QO-58溶液采用了聚氧乙烯蓖麻油溶解，蓖麻油可以延遲QO-58在胃中的吸收。而無(wú)論2 h還是18 h肝臟中藥物濃度始終比較高，提示藥物可能主要在肝臟代謝。值得注意的是藥物雖然脂溶性很高，但是并沒(méi)有在脂肪、腦部位分布有明顯增高，提示藥物不會(huì)出現(xiàn)蓄積。藥物在心臟分布濃度始終不高，這是一種很好的現(xiàn)象，由于藥物對(duì)心臟的KCNQ1/KCNE1通道有開(kāi)放活性，可能會(huì)因?yàn)樵谠摻M織分布濃度較低而不產(chǎn)生明顯心臟毒性作用。給藥7 h腎臟有較高藥物濃度分布，提示藥物可能會(huì)經(jīng)過(guò)腎臟排泄。整個(gè)分布過(guò)程中，血漿中藥物濃度始終比較高，僅次于肝臟，提示藥物與血漿蛋白結(jié)合可能性比較大。至于藥物為什么會(huì)在肺中有較高分布，及會(huì)帶來(lái)哪些影響，還需要做進(jìn)一步的研究。

盡管藥物治療癲癇的主要作用靶點(diǎn)在中樞(腦)，但在腦分布的濃度不是很高，提示藥物可能不需要太高的劑量，只要保持腦內(nèi)一定的藥物濃度就會(huì)起效，因此低劑量重復(fù)給藥可能要比高劑量單次給藥方案更利于藥效發(fā)揮。

由于QO-58為原料藥，采用聚氧乙烯蓖麻油溶解后灌胃給藥，導(dǎo)致大鼠組織樣本中的濃度個(gè)體差異大，因此為了保證后期實(shí)驗(yàn)和臨床給藥的均一穩(wěn)定，其制劑類(lèi)型還需要進(jìn)一步研究。

［1］ Qi J，Zhang F，Mi Y，et al.Synthesis and biological activity of pyrazolo［1，5-a］pyrimidin-7(4H)-ones as novel Kv7/KCNQ potassium channel activators［J］.Eur J Med Chem，2011，46(3):934－43.

［2］ An G，Morris M E.HPLC analysis of mitoxantrone in mouse plasma and tissues:Application in a pharmacokinetic study［J］.J Pharmacol Biomed Analys，2010，(51):750 －3.

［3］ Zhang Y S，Zhang Q Y，Li L Y，et al.Simultaneous determination and pharmacokinetic studies of dihydromyricetin and myricetin in rat plasma by HPLC-DAD after oral administration of Ampelopsis grossedentata decoction［J］.J Chromatography B Analyt Technol Biomed Life Sci，2007，860(1):4 －9.

［4］ 郝海平，王廣基.臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)關(guān)鍵技術(shù)與研究體系［J］.中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，39(2):97 －102.

［4］ Hao H P，Wang G J.Key technologies and research systems in preclinical drug metabolism and pharmacokinetics［J］.J China Pharm Univ，2008，39(2):97 －102.

［5］ 李 柯，鐘大放.效液相色譜法測(cè)定大鼠組織及血漿中9-硝基喜樹(shù)堿含量［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2003，38(2):124 －8.

［5］ Li K，Zhong D F.Determination of 9-nitrocamptothecin in rat plasma and tissues by high performance liquid chromatography［J］.Acta Pharm Sin，2003，38(2):124 －8.

［6］ 楊秀偉，桂方晉，田建明.人參皂苷-Rg2在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(7):967 －70.

［6］ Yang X W，Gui F J，Tian J M，et al.Pharmacokinetics of ginsenoside-Rg2 in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(7):967 －70.

［7］ 白 靜，余 剛，劉秀文，等.重組人胰高血糖素類(lèi)肽-1(7-36)的藥動(dòng)學(xué)與組織分布［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2011，27(1):62 －5.

［7］ Bai J，Yu G，Liu X W，et al.The pharmacokinetics and tissue distribution of recombinant human glucagon-like peptide 1(7-36)［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(1):62 －5.