黑曲霉蘋果酸酶基因的敲除及其功能研究

尹升明,耿紅冉，周 闖，劉 浩

(1.天津科技大學生物工程學院 工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457；2.中國生物技術發展中心，北京 100039)

黑曲霉在生物技術產業中有著重要的應用價值，不僅廣泛應用于食品、藥物和工業酶制劑的生產，同時也是表達外源蛋白的細胞工廠[1]。黑曲霉基因組測序已完成，大約包括3400萬個堿基，為基礎和應用性研究提供了極大的便利，但黑曲霉大部分基因功能仍是未知的[2]，因此對黑曲霉的研究不能僅依賴于生物信息學，更需要采用分子生物學手段對其基因功能進行研究[3]。

蘋果酸酶(Malic enzyme，ME)廣泛存在于自然界中[4～6]，是調控蘋果酸代謝的關鍵酶，可以催化蘋果酸氧化脫羧的可逆反應以及伴隨NAD(P)+的還原反應。線粒體中的NAD-ME催化丙酮酸脫羧，在TCA循環中起重要作用[7]。采用分子生物學探討ME基因在黑曲霉中的功能將為研究蘋果酸代謝及其輔酶再生奠定基礎[8]。

作者在此利用農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導的轉化方法轉化黑曲霉，通過同源重組敲除黑曲霉ME基因，篩選ME基因敲除菌株，對其進行發酵實驗來研究ME基因在TCA循環中的作用，并對ME基因敲除菌株的生長、發育和代謝進行了深入研究。

1 實驗

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

黑曲霉野生型菌株，編號ATCC1015，由中科院天津工業微生物研究所孫際濱實驗室提供；農桿菌AGL1、大腸桿菌(E.coli)DH5α、質粒p44(由pCAMBIA1300改造而來)，均自行保存。

1.1.2 培養基

LB培養基(g·L-1)：蛋白胨 10，酵母浸出物 5，NaCl 10。固體培養基加瓊脂 20 g·L-1[9]。

馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA)：稱取去皮馬鈴薯200 g，切成小塊，加1000 mL水煮沸30 min，用雙層紗布濾成清液，加水至1000 mL，然后加入20 g葡萄糖完全溶解，pH值自然。固體培養基加瓊脂20 g[10]。

誘導培養基(IM)及真菌完全培養基(CM)參照文獻[11]配制。

發酵培養基(g·L-1)：葡萄糖50，NH4NO32.5，KH2PO42.0，MgSO4·7H2O 1.0，NaCl 1.0，CaCl20.1，酵母浸出物 0.5，FeSO4·7H2O 0.0005，ZnSO4·7H2O 0.0005，CuSO4·5H2O 0.00025[9]。

1.1.3 酶與試劑

限制性內切酶HindⅢ、PstⅠ、BamHⅠ、KpnⅠ、T4DNA ligase、Taq DNA Polymerase，Fermentas公司；KOD FX，東洋紡(上海)生物科技有限公司；PCR產物純化及膠回收試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物，OXOID公司；其它試劑均為國產色譜純。

1.1.4 引物

本實驗所用黑曲霉菌株為A.nigerATCC1015，其基因組測序工作已于2006年完成，并在http://genome.jgi-psf.org/公布，本實驗所涉及到的與ME基因相關序列均通過該網站獲得。采用的引物見表1。

表1 PCR引物

注：上述引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成

1.2 方法

1.2.1ME基因敲除質粒p44-ME::hyg的構建

首先以A.nigerATCC1015的基因組為模板，利用引物ME-upf/ME-upr、ME-downf/ME-downr進行PCR擴增，分別得到ME基因的5′端片段及3′端片段。PCR擴增條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性40 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸5 min。然后將5′端片段與p44質粒分別酶切(BamHⅠ/KpnⅠ)后連接得到p44-ME1，將3′端片段與p44-ME1用HindⅢ/PstⅠ酶切后連接得到p44-ME::hyg。最后將p44-ME::hyg分別用BamHI/KpnⅠ與HindⅢ/PstⅠ酶切驗證。

1.2.2 農桿菌介導T-DNA轉化

將構建好的質粒p44-ME::hyg轉入農桿菌AGL1[12]，在誘導培養基上活化至OD=0.8后，取100 μL該菌液與等量的黑曲霉孢子(1×107個·mL-1)滴加在0.45 μm醋酸纖維素膜上，然后將膜貼在誘導培養基(含200 μmol·L-1AS和100 μg·mL-1Kanamycin)上，30 ℃培養48～72 h。

1.2.3ME基因敲除菌株的篩選鑒定

將共培養物轉移至篩選培養基(CM+200 μmol·L-1Cefotaxine+200 μg·mL-1Hygromycin)上，30 ℃培養4～5 d，得到黑曲霉轉化子。然后在PDA液體培養基中30 ℃、200 r·min-1培養2～3 d，得到菌絲體。采用苯酚-氯仿抽提法提取基因組，通過常規PCR擴增篩選出ME基因敲除菌株。PCR所用聚合酶為KOD FX。PCR擴增條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，30個循環；68 ℃延伸5 min。

1.2.4 目的菌株的發酵

發酵罐規格為貝朗A plus 5 L，裝液量為4 L。采用孢子接種，接種量為5×108個·mL-1，初始pH值2.5，轉速 200 r·min-1，通氣量0.3 vvm；孢子萌發后(大約16 h)pH值4.5，轉速 600 r·min-1，通氣量1 vvm。用1 mol·L-1NaHCO3與2 mol·L-1HCl調節pH值[13]。每隔12 h取樣檢測。

1.2.5 發酵液中有機酸含量的測定

采用高效液相色譜法(HPLC)測定。取發酵液2 mL通過0.22 μm微孔濾膜過濾得到清液，稀釋適當倍數用于液相色譜分析。使用Bio-Rad Aminex?HPX-87H有機酸專用液相色譜柱；有機酸含量采用紫外檢測器檢測，檢測波長為210 nm；甘油及殘糖含量采用視差檢測器檢測；流動相為5 mmol·L-1硫酸溶液；流速0.6 mL·min-1；柱溫65 ℃；進樣量10 μL[14]。根據標準曲線計算發酵液中相關物質的含量。

2 結果與討論

2.1 ME蛋白結構預測及曲霉家族ME蛋白序列比對(圖1)

黑曲霉基因組數據預測ME基因編碼含666個氨基酸的蛋白，Broadinstitute預測該蛋白中含有一個N-端結構域和一個NAD結合結構域(圖1a)。

從基因組數據庫中獲取曲霉家族ME蛋白序列并采用clustalx1.83軟件進行比對，發現該蛋白在曲霉屬中相似度均大于85%，說明該蛋白在曲霉屬中十分保守(圖1b)。

圖1 ME蛋白結構預測及曲霉家族ME蛋白序列比對

2.2 敲除質粒p44-ME::hyg的構建

采用苯酚-氯仿抽提法提取黑曲霉ATCC1015基因組，用作常規PCR的模板，分別擴增黑曲霉ME基因的上下游各1.0 kb的片段，并將它們分別連接到質粒p44潮霉素基因的上下游，得到敲除質粒p44-ME::hyg(圖2a)。將p44-ME::hyg分別用BamHⅠ/KpnⅠ與HindⅢ/PstⅠ進行酶切，各得到一條1.0 kb左右的條帶，分別為連接到質粒上的ME基因的上下游同源臂,說明 p44-ME::hyg構建成功，是需要的含有同源臂的敲除質粒(圖2b)。

M.Marker 1.Bam HⅠ/Kpn Ⅰ酶切 2.Hin dⅢ/Pst Ⅰ酶切

2.3 ME基因敲除菌株的篩選與鑒定

在共培養過程中，同源序列可能發生交換，產生敲除菌株(圖3a)。共培養物在篩選培養基上生長出轉化子，選擇30株單獨培養，得到菌絲體，提取DNA并進行PCR驗證，得到1株敲除菌株△ME。提取野生株和突變株基因組，利用ME-upf1/ME-downr1進行引物PCR驗證，野生株(圖3b 1#泳道)有一條1.2 kb左右的目的條帶，而突變株(圖3b 2#泳道)沒有(后面引物所在部分被潮霉素基因取代了)；利用ME-upf1/ME-hyg引物進行PCR驗證，突變株(圖3b 4#泳道)有一條1.2 kb左右的目的條帶，而野生株(圖3b 3#泳道)則沒有(野生株沒有潮霉素基因)。

這些表明菌株△ME即為敲除ME基因后的突變菌株。

M.Marker 1.ME-upf1/ME-downr1，WT 2.ME-upf1/ME-downr1,△ME 3.ME-upf1/ME-hyg，WT 4.ME-upf1/ME-hyg,△ME

2.4 菌體和殘糖的測定

將野生株與△ME突變株單獨發酵培養，每隔12 h取樣檢測菌體干重與殘糖量，結果見圖4。

圖 4 發酵過程曲線

由圖4可看出，野生株與△ME突變株的菌體生長狀況相似，并且殘糖量也非常接近，說明ME基因的敲除對菌體生長的影響并不明顯。

2.5 發酵過程代謝物含量的測定

將野生株與△ME突變株單獨發酵培養96 h，每12 h取一次樣，將菌液通過0.22 μm濾膜過濾，采用HPLC測定代謝物含量，結果見圖5。

圖5 代謝物最高產量

由圖5可看出，與野生株相比，△ME突變株檸檬酸、草酸、丙酮酸以及蘋果酸的產量沒有明顯變化，說明ME基因的敲除對代謝影響不大。

2.6 討論

雖然不同生物體中ME有不同的生理功能，但它們的氨基酸序列卻高度保守。根據大腸桿菌MaeB的氨基酸序列，可以推測出它含有3個保守結構域，其中N-端結構域和NAD結合結構域為蘋果酸酶所特有；C-端結構域與沒有蘋果酸酶活性但能夠催化乙?；恨D化成正磷酸鹽的PTA(Phosphotransacetylases)同源[15]。

卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)中的蘋果酸酶被認為是該真菌中生物合成多不飽和脂肪酸所需要的重要酶，它持續為脂肪酸合成酶進行鏈延伸提供NADPH[6]。在植物的TCA循環過程中，線粒體中NAD-ME催化丙酮酸脫羧[7]。在對擬南芥的研究中發現，NADP-ME只在特定的發育階段發揮作用[16]。

3 結論

將黑曲霉中的ME基因敲除之后獲得1株ME基因敲除的突變株。對突變株進行發酵研究，發現其TCA循環各種有機酸、檸檬酸、草酸、丙酮酸以及蘋果酸的產量與野生株相比沒有明顯變化，說明ME基因的敲除對代謝并沒有產生明顯影響。在真菌中，由于其代謝系統的復雜性，如在TCA循環中存在很多代謝支路及其代謝相關的酶，單個基因敲除后對代謝的影響可能不是很大。

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