正十六烷降解菌的分離、鑒定及降解特性

張 楠，陳波水，方建華，王 九

(解放軍后勤工程學院，重慶 401311)

石油及石油產品主要由烷烴和芳香烴等碳氫化合物組成，因其固有的生態毒性和難生物降解性而給環境帶來嚴重的危害[1，2]，石油烴污染環境的原位修復和異位修復一直是研究熱點[3～7]。生物修復通過添加營養物質和(或)微生物提高污染物在環境中的生物降解能力[8，9]，是治理烴污染的有效方法。石油烴的生物降解過程和降解程度受溫度、pH值和微生物營養物質(如某些含N、P的化合物)等因素的影響[10～14]。深入研究石油烴的生物降解過程和機制、了解烴降解菌的生理生化特性，是實現烴污染環境生物修復的重要基礎。

作者在此以正十六烷(以下簡稱C16)為唯一碳源，通過富集培養從石油污染土壤中分離出1株C16降解菌，在對菌株進行鑒定的基礎上，考察不同pH值條件下菌株對C16的降解能力，以期為石油烴污染的生物修復提供幫助。

1 實驗

1.1 土壤樣本

重慶某油庫儲油罐附近土壤(砂土和沙壤土)。

1.2 主要培養基

無機鹽培養基：NaCl 0.1 g，NH4NO30.1 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，KCl 0.01 g，CaCl20.05 g，用NaH2PO4-NaOH調節pH=5.0或用KH2PO4-K2HPO4調節pH=6.0、7.0、7.8，蒸餾水定容至100 mL，于121 ℃蒸汽滅菌30 min。

C16富集培養基：1.0 g C16加入100 mL無機鹽培養基中。

C16無機鹽培養基：0.2 g C16加入100 mL無機鹽培養基中。

1.3 C16降解菌的分離與鑒定

1.3.1 菌株的分離

采用富集法對C16降解菌進行分離、純化。方法如下：土壤樣本經破碎、過篩、除雜、混勻后，稱取50 g加入250 mL無菌水中，充分振蕩，浸泡并曝氣24 h；取適量接種于100 mL C16富集培養基中馴化，在37 ℃、160 r·min-1下振蕩培養，10 d為1個馴化周期，經3個馴化周期后，取富集培養液在LB平板上分離、純化；據含甘油培養物保藏法于-70 ℃保存備用。

將純菌種接種于LB液體培養基，于32 ℃、200 r·min-1下振蕩培養12 h，8500 r·min-1離心10 min，去上清，稱菌體濕重，用無機鹽培養基配成10%(質量分數，下同)的菌懸液，備用。

1.3.2 菌株的鑒定

菌株的形態觀察方法參見文獻[15]。采用VITEK32型全自動微生物分析儀進行自動化鑒定。

1.4 C16降解菌的降解特性測定

1.4.1 標準曲線的繪制

準確稱取C16(分析純)0.0520 g、0.1011 g、0.1523 g、0.2024 g、0.2491 g，分別置于10 mL容量瓶中，用正己烷(分析純)定容并混勻。采用氣相色譜[GC900氣相色譜儀：FID檢測器；OV17毛細管氣相色譜柱；載氣(高純N2)流速50 mL·min-1；燃燒氣(H2)流速50 mL·min-1；空氣流速100 mL·min-1；檢測器溫度220 ℃；進樣器溫度280 ℃；柱溫220 ℃；進樣量0.5 μL]測定C16的色譜峰面積，采用外標法對峰面積(y)和C16質量(x)進行回歸并繪制標準曲線。

1.4.2 降解特性研究

在pH值為7.0的100 mL C16無機鹽培養基中加入10%的菌懸液0.5 mL，于34 ℃、200 r·min-1搖床振蕩培養一定時間后，依次加入15 g NaCl、10 mL正己烷和100 μL 6 mol·L-1的HCl，于32 ℃、200 r·min-1搖床振蕩20 min，然后將培養液倒入分液漏斗靜置、分層，取上層清液置于25 mL消解管，加入1 g無水Na2SO4，搖勻，放入4 ℃冰箱中靜置1 d，采用氣相色譜測定C16峰面積，根據標準曲線計算C16質量，依下式計算C16降解率ε：

式中：m為C16降解后的質量，g；m0為C16降解前的質量，g。

1.4.3 pH值對菌株降解能力的影響

分別在pH值為5.0、6.0、7.0、7.8的100 mL C16無機鹽培養基中加入10%的菌懸液0.5 mL，于34 ℃、200 r·min-1搖床振蕩培養5 d，采用氣相色譜測定峰面積，計算C16降解率。

2 結果與討論

2.1 菌株的鑒定

從土壤樣本中分離出1株以C16為唯一碳源的菌株。該菌株在LB平板上的生長情況以及經革蘭氏染色后的形態見圖1。

圖1 菌株的形態

由圖1可知，所分離的菌株在LB平板上的生長菌落為中等大小，不規則形，中間凸起，表面濕潤，透明，邊緣不整齊，平板呈淺綠色，革蘭氏染色陰性；在油鏡下呈卵圓形或短桿狀。

菌株全自動微生物分析鑒定結果見表1。

表1 菌株自動化鑒定結果

注：“-”表示反應結果為陰性；“+”表示反應結果為陽性

由圖1和表1初步確定菌株為銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。

2.2 C16的標準曲線(圖2)

圖2 C16的標準曲線

由圖2可知，擬合的C16回歸方程為：y=4942620x-5984,R2=0.9933。表明C16的質量與峰面積呈良好的線性關系。

2.3 菌株對C16的降解作用

接種微生物的培養液中C16降解率隨降解時間的變化見圖3。

圖3 C16降解率隨降解時間的變化

由圖3可知，C16降解率隨降解時間的延長而升高，尤其是第3 d后降解率升幅更為明顯，到第6 d時降解率達97.3%。表明所分離的菌株具有良好的降解C16的能力，是有效的C16降解菌。

2.4 pH值對菌株降解能力的影響

不同pH值條件下，接種微生物的培養液培養5 d后的C16降解率見圖4。

圖4 C16降解率隨pH值的變化

由圖4可知，在弱酸性至弱堿性(pH值6.0～7.8)條件下，C16能較好地被銅綠假單胞菌所降解；不同pH值下的降解率大小依次為pH值7.0>pH值6.0>pH值7.8>pH值5.0，即中性條件(pH值7.0)最適宜C16降解。在較強酸性條件(pH值5.0)下，菌株降解C16的能力較差，可能是酸性條件下菌株代謝途徑改變的緣故。

3 結論

經過富集培養、分離，獲得1株以C16為唯一碳源的菌株。根據形態觀察和自動化分析鑒定，初步確定該菌株為銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。氣相色譜分析結果表明，所分離的銅綠假單胞菌菌株具有良好的降解C16的能力，且在中性條件下的降解能力最強。

參考文獻：

[1] Bartz W J.Lubricants and the environment[J].Tribology International，1998，31(1-3)：35-47.

[2] Haus F，German J，Junter G A.Primary biodegradability of mineral base oils in relation to their chemical and physical characteristics[J].Chemosphere，2001，45(6-7)：983-990.

[3] 陸光華，萬蕾，蘇瑞蓮.石油烴類污染土壤的生物修復技術研究進展[J].生態環境，2003，12(2)：220-223.

[4] Rojas-Avelizapa N G，Roldá-Carrillo T，Zegarra-Martíez H，et al.A field trial for an ex-situ bioremediation of a drilling mud-polluted site[J].Chemosphere，2007，66(9)：1595-1600.

[5] 蘇增建，谷慧宇，李敏.海洋石油污染修復研究進展[J].安全與環境學報，2009，9(2)：56-65.

[6] 陳立，萬力，張發旺，等.土著微生物原位修復石油污染土壤試驗研究[J].生態環境學報，2010，19(7)：1686-1690.

[7] 羅洪君，王緒遠，趙騫，等.石油污染土壤生物修復技術的研究進展[J].四川環境，2007，26(3)：104-109.

[8] 錢欣平，陽永榮，孟琴.生物表面活性劑對微生物生長和代謝的影響[J].微生物學通報，2002，29(3)：75-78.

[9] Nocentini M，Pinelli D，Fava F.Bioremediation of a soil contaminated by hydrocarbon mixtures：The residual concentration problem[J].Chemosphere，2000，41(8)：1115-1123.

[10] 李麗，張利平，張元亮.石油烴類化合物降解菌的研究概況[J].微生物學通報，2001，28(5)：89-92.

[11] 李習武，劉志培.石油烴類的微生物降解[J].微生物學報,2002,42(6)：764-767.

[12] Atlas R M.Microbial degradation of petroleum hydrocarbons：An environmental perspective[J].Microbiol Rev，1981，45(1)：180-209.

[13] Leahy J G，Colwell R R.Microbial degradation of hydrocarbons in the environment[J].Microbiol Rev，1990，54(3)：305-315.

[14] 馬強.高效石油烴降解菌的分離、鑒定及降解能力研究[D].北京：北京化工大學，2008.

[15] 錢存柔，黃儀秀.微生物學實驗教程(第二版)[M].北京：北京大學出版社，2008：23-36，94-100.