丹皮酚合成過程中抑菌活性的變化研究

于曙光，鄭國生，潘大仁

(1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)院，福建 福州 350002；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院,山東 青島 266109；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)研究生處,山東 青島 266109)

丹皮酚，又名芍藥醇、牡丹酚，化學(xué)名為2-羥基-4-甲氧基苯乙酮，是牡丹干燥根或全草的主要有效活性成分，具有抑菌抗炎、解熱鎮(zhèn)痛、降壓利尿、抗凝血、抗過敏、增強(qiáng)免疫功能等作用[1，2]，在醫(yī)藥、香料、化工領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。

天然丹皮酚都是從中草藥中提取，如從徐長卿和牡丹皮中通過水蒸氣蒸餾、超臨界萃取等方法提取[3～5]。由于原料昂貴，提取效率較低，使丹皮酚的應(yīng)用受到了很大的限制。化學(xué)合成使丹皮酚大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)成為可能，且節(jié)約了天然藥材資源。化學(xué)合成法是將間苯二酚乙酰化制得2，4-二羥基苯乙酮,再經(jīng)甲基化制得丹皮酚[6]。

作者在此采用化學(xué)合成法，考察丹皮酚在化學(xué)合成過程中3種化合物(原料間苯二酚、中間產(chǎn)物2，4-二羥基苯乙酮、主產(chǎn)物丹皮酚)抑菌活性的變化，從而初步了解丹皮酚的各個(gè)官能團(tuán)在抑菌過程中的作用，擬為丹皮酚抑菌作用機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)，為研發(fā)高抑菌活性的丹皮酚衍生物提供幫助[7]。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 丹皮酚的合成

丹皮酚的合成路線如下：

1.1.1 由間苯二酚合成2，4-二羥基苯乙酮

在250 mL三口燒瓶中加入15.4 mL冰乙酸,攪拌回流并控制油浴溫度為110 ℃,加入20.5 g干燥的氯化鋅,待氯化鋅全溶后,加入間苯二酚11.2 g，然后升溫至145 ℃回流2.0 h,將反應(yīng)液倒入20 mL稀鹽酸中室溫冷卻，放入冰箱0 ℃冷藏2 h,抽濾。用冰水洗滌反應(yīng)物,得橙黃色固體,再用0.1 mol·L-1稀鹽酸重結(jié)晶,自然冷卻后再冷藏2 h,抽濾得到橙黃色針狀晶體,干燥,稱重，測(cè)熔點(diǎn)，并經(jīng)GC-MS進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)及純度測(cè)定。

1.1.2 由2，4-二羥基苯乙酮合成丹皮酚

稱取2，4-二羥基苯乙酮1.52 g加入到100 mL三口燒瓶中,依次加入碳酸鉀1.38 g、三乙基芐基胺(TEBA)0.23 g、丙酮20 mL,攪拌15 min后加入碘甲烷0.75 mL，水浴恒溫30 ℃,攪拌回流 3 h至反應(yīng)完全。蒸餾除去丙酮后加入10 mL蒸餾水,再用鹽酸調(diào)pH=2至固體析出。水蒸氣蒸餾直至餾出液澄清透明。室溫冷卻后,放入冰箱0 ℃冷藏12 h,抽濾，干燥,稱重，測(cè)熔點(diǎn)，并經(jīng)GC-MS進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)及純度測(cè)定。

1.2 抑菌活性的測(cè)定

1.2.1 PDA培養(yǎng)基的配制

取200 g洗凈去皮的土豆切塊，加入1000 mL水，加熱煮沸30 min左右，3層紗布過濾，取濾液加入20 g葡萄糖、15 g瓊脂，加熱煮沸3次后定容至1000 mL，趁熱分裝錐形瓶中，根據(jù)所需的濃度加入適量的間苯二酚、2，4-二羥基苯乙酮和丹皮酚，121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 菌種的培養(yǎng)和菌餅的制備

選皿底平坦、直徑為6 cm的潔凈培養(yǎng)皿，經(jīng)干燥滅菌后，在無菌操作條件下傾入PDA培養(yǎng)基，制成平板。待冷凝后接入供試菌種。置25 ℃恒溫箱培養(yǎng)，待菌落均勻布滿培養(yǎng)基時(shí)，用直徑為9 mm的打孔器在上述菌落邊緣切下帶菌培養(yǎng)基，即為菌餅。

供試菌種為11種植物病原真菌：白菜黑斑病菌(HB)、蘋果腐爛病菌(FL)、黃瓜枯萎病菌(HK)、小麥赤霉病菌(CM)、小麥紋枯病菌(WK)、大蔥紫斑病菌(ZB)、黃瓜灰霉病菌(HM)、葡萄炭疽病菌(PTJ)、棉花枯萎病菌(MK)、蘋果斑點(diǎn)落葉病菌(BDLY)、葡萄黑痘病菌(PHD)。

1.2.3 抑菌活性的測(cè)定

取已滅菌的含有間苯二酚、2，4-二羥基苯乙酮和丹皮酚的培養(yǎng)基，趁熱搖勻，迅速倒入直徑9 cm的培養(yǎng)皿中制成平板。每平板約需培養(yǎng)基15 mL左右，每種物質(zhì)重復(fù)3次，同時(shí)每個(gè)菌種制作一個(gè)空白對(duì)照平板。

待上述各培養(yǎng)基冷凝后，在超凈臺(tái)上用接種針將菌種按每皿一針分別移入不同的培養(yǎng)基中，置于25 ℃左右的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天測(cè)量菌落直徑，直至空白對(duì)照組的培養(yǎng)皿長滿菌落。每個(gè)菌落按十字交叉法測(cè)量，其平均值即為菌落直徑。按下式計(jì)算抑菌率：

式中：純生長量(mm)=菌落直徑-菌餅直徑。

1.2.4 最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

將具有抑菌效果的物質(zhì)的濃度進(jìn)行逐級(jí)稀釋后進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，以不長菌的最低的溶液濃度作為最低抑菌濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 2，4-二羥基苯乙酮和丹皮酚的結(jié)構(gòu)表征

(1)2，4-二羥基苯乙酮 熔程142.6～143.3 ℃(文獻(xiàn)值142.0～144.0 ℃)。經(jīng)GC-MS譜圖分析，m/z為152、137、81、69、53、43,可以確認(rèn)該化合物為2，4-二羥基苯乙酮，純度為99%。

(2)丹皮酚 熔程48.6～49.3 ℃(文獻(xiàn)值49.0～51.0 ℃)。經(jīng)GC-MS譜圖分析，m/z為166、151、108、95、69、43，可以確認(rèn)該化合物為丹皮酚，純度為100%。

2.2 不同濃度丹皮酚對(duì)11種病原真菌的抑制作用(表1)

表1 不同濃度丹皮酚對(duì)11種病原真菌的抑制作用

由表1可以看出，丹皮酚濃度為0.5 g·L-1時(shí)，對(duì)11種病原真菌均具有較強(qiáng)的抑菌活性，且有明顯差異。因此，采用0.5 g·L-1丹皮酚考察各物質(zhì)的抑菌率，從而對(duì)比抑菌活性的變化。

2.3 3種物質(zhì)對(duì)11種病原真菌的抑菌率及最低抑菌濃度的比較

在相同濃度(0.5 g·L-1)下，間苯二酚、2，4-二羥基苯乙酮和丹皮酚對(duì)11種病原真菌的抑菌率和最低抑菌濃度對(duì)比見表2。

由表2可以看出，0.5 g·L-1的2，4-二羥基苯乙酮的抑菌率大于或等于同濃度丹皮酚的抑菌率，兩者均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于同濃度間苯二酚的抑菌率。

3種物質(zhì)對(duì)于11種病原真菌的最低抑菌濃度差別很大，但對(duì)于同種真菌而言，2，4-二羥基苯乙酮的最低抑菌濃度都是最小的，這也意味著對(duì)于上述11種病原真菌， 2，4-二羥基苯乙酮的抑菌效果是最好的。由此可推測(cè)，酚類分子中乙酰基的引入對(duì)抑菌活性起到了非常重要的作用，而酚羥基的甲基化的作用卻并不顯著。

表2 3種物質(zhì)對(duì)11種病原真菌的抑菌率及最低抑菌濃度的比較

3 結(jié)論

研究了在丹皮酚合成過程中，原料間苯二酚、中間產(chǎn)物2，4-二羥基苯乙酮、主產(chǎn)物丹皮酚對(duì)11種植物病原真菌的抑菌活性的變化，并通過這種變化來推測(cè)影響丹皮酚抑菌活性的主要官能團(tuán)。從3種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)表征及對(duì)應(yīng)的抑菌活性可以初步推測(cè)：在酚類分子中，單獨(dú)的酚羥基的抑菌活性較低，乙酰基的引入大幅提高了抑菌活性，而酚羥基的甲基化對(duì)抑菌活性的影響不大。

參考文獻(xiàn)：

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