粉塵螨變應原第10組分基因克隆表達及生物信息學分析①

周 鷹 孫金霞 楊 李 王運剛 馬桂芳 崔玉寶 (鹽城衛生職業技術學院，鹽城224006)

傳統采用藥物治療Ⅰ型變態反應性疾病，只能暫時緩解患者癥狀，而變應原特異性免疫治療具有特異性、可根除疾病的優點［1］。目前，臨床普遍使用變應原粗提浸液混合物進行免疫治療，其成分復雜，含有變應原、非變應原、甚至于毒性蛋白成分，因此臨床應用會發生副反應，嚴重者會威脅患者生命［2-4］。重組DNA技術為變應原的生產提供了新的途徑，通過基因工程技術可以按照人類意志降低變應原的致敏性。迄今，人們已經獲得數百種重組變應原，為過敏性疾病患者個體化診療提供了可能，重組變應原用于皮下注射和舌下含服免疫治療過敏性疾病也進入了臨床研究［5，6］。

國際免疫學會聯合會(WHO/IUIS，http://www.allergen.org)已命名了23組塵螨變應原，了解這些變應原組分的分子特征必將有助于臨床診斷和治療塵螨過敏性疾病。此外，已有報道多組變應原組分存在多態性，并影響其臨床診斷和治療效果［7］。因此，有必要了解我國塵螨變應原各組分的免疫生物學特征。本課題組采用基因工程技術先后獲得了粉塵螨變應原第1至10組分的編碼基因，現將第10組分基因克隆表達結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 EcoRⅠ酶、HindⅢ酶、TaKaRa RNAiso Reagent(Code No.D312)、High Fidelity PrimeScriptTMRT-PCR Kit(TaKaRa Code No.DR027A)、Prime-STAR?HSDNA(TaKaRa Code No.DR010A)、TaKa-Ra DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0(Code No.DV807)、TaKaRa DNA A-Tailing Kit(Code No.D404)、TaKaRa DNA Ligation Kit＜ Mighty Mix＞(Code No.D6023)、pMD19-T simple(Code No.D104)、E.coli Competent Cells JM109(Code No.D9052)、TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(Code No.DV805)、Protein marker 均購自大連寶生物公司。E.coli BL21(DE3)Stratagene公司生產。pET28a(+)(Kit Lot No.N72770)及Perfect protein marker由Novagen公司生產。Precision Plus Protein Standards購自Bio-Rad公司。True blue PEROXIDASE Substrate由Kirkegaard＆Perry Laboratories(KPL，Gaithersburg，MD)提供。Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)(Code No.D9030A)、CBB-R250染色、PVDF膜、Western blot膜封閉液、CBB-R250染色液購自天根生化科技(北京)有限公司。Penta-His Antibody(BSA free)購自QIAGEN公司。HRP-Robbit Anti-Mouse IgG(H+L)購自ZYMED Laboratories公司。其他化學試劑均為國產分析純。TP3000 PCR 儀(TaKaRa Bio Inc.)，Mupid電泳儀(Advance-Bio Co.，Ltd)，ImageMaster?VDS電泳成像裝置(Pharmacia Biotech)，ABI PRISMTM377XL DNA Sequencer DNA測序儀(Perkin Elmer)。

1.2 方法 解剖鏡下挑取粉塵螨(Dermatophagoides farinae)約600只，勻漿后用TaKaRa RNAiso Reagent試劑盒提取總RNA，操作按說明書進行。根據GenBank(EU 106617)公布的Der f 10 CDS區序列設計引物，并加入BamHⅠ/HindⅢ酶切位點，由寶生物工程(大連)有限公司合成如下:上游引物F:GC-3'，下游引物GTGGTGGTGCTCGAG-3'，下游引物R2:5'-GTGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCATAACCAGTAA-3'。以總RNA為模板，反轉錄后經套式PCR擴增出目的基因并克隆至pMD19-T simple載體測序，將測序正確的目的基因插入表達質粒pET28a(+)，轉入E.coli BL21(DE3)表達，用 SDS-PAGE和 Western blot鑒定重組蛋白。

1.2.1 反轉錄 使用 High Fidelity PrimeScriptTMRT-PCR Kit(Code No.DR027A)進行反轉錄試驗，取Eppendorf管1支，依次加入總 RNA 1μl、各10 mmol/L dNTP Mixture 0.5 μl、20 μmol/L Random 6 mers 0.5 μl和RNase Free dH2O 3 μl，65℃水浴5 分鐘后，立即置冰上放置2分鐘，然后加入5×Prime-Script RT Buffer 2 μl、40 U/μl RNase Inhibitor 0.25 μl、PrimeScript RTase 0.5 μl、RNase Free dH2O 2.25 μl，置30℃ 10分鐘、42℃30分鐘、70℃15 分鐘進行反應。

1.2.2 套式PCR擴增 Der f 10全長 cDNA 使用PrimeSTAR?HS DNA Polymerase(Code No.DR010A)，進行PCR擴增，PCR反應總體積25μl，具體組成如下:上述反轉錄反應液2μl，5×Prime-STAR PCR Buffer 5 μl，各 2.5 mmol/L dNTP Mixture 2μl、10 μmol/L上游引物F 1 μl、10μmol/L下游引物 R21 μl、2.5 U/μl PrimeSTAR?HS DNA Polymerase 0.25 μl、dH2O 13.75 μl。反應條件:94℃變性2分鐘后，98℃ 10秒、55℃ 30秒、72℃ 30秒條件下進行30個循環，72℃ 5分鐘延伸。取上述PCR產物進行二次PCR，反應體積50μl，組成如下:上述PCR反應液2 μl、5 ×PrimeSTAR PCR Buffer 10 μl、各2.5 mmol/L dNTP Mixture 4 μl、10 μmol/L上游引物F 1 μl、10 μmol/L 下游引物 R11 μl、2.5 U/μl Prime-STAR?HSDNA Polymerase 0.25 μl、dH2O 31.5 μl。反應條件:94℃變性2分鐘后，98℃ 10秒、55℃ 30秒、72℃ 30秒條件下進行30個循環，72℃ 5分鐘延伸。取5μl PCR產物上樣電泳，觀察目的條帶。

1.2.3 克隆載體構建、陽性克隆篩選及鑒定 回收上述PCR產物，加“A”尾、DNA精制后，將目的基因片段與pMD19-T Simple Vector(Code No.D104)連接后，熱轉化至感受態 E.coli JM109(Code No.D9052)，涂布于含氨芐青霉素(100μg/ml)的LB平板上，37℃培養過夜。隨機挑取16個白色菌落，利用載體上的引物進行PCR擴增后行瓊脂糖凝膠電泳，含有目的條帶的菌落為陽性克隆菌。取陽性克隆菌置于含氨芐青霉素的TB培養液中，37℃振搖培養過夜。取重組陽性克隆，提取質粒，用 Bam HⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定pMD19-T-Der f 10，酶切反應體積為 10 μl，組成為重組質粒 1 μl、15 U/μl的BamHⅠ0.5 μl、15 U/μl的 Hind Ⅲ 0.5 μl、K Buffer 1 μl，dH2O 7 μl、37℃水浴30 分鐘，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切片段的大小。以重組質粒DNA為模板，委托寶生物工程(大連)有限公司進行序列測定。

1.2.4 表達質粒pET28a(+)-Der f 10的構建及鑒定 用BamHⅠ和HindⅢ對上述陽性質粒進行雙酶切，反應體積 50 μl，組成如下:約 200 ng/μl的pMD19-T-Der f 10 5 μl、10 × K Buffer 5 μl、15 U/μl BamHⅠ 1.5 μl、15 U/μl Hind Ⅲ1.5 μl、dH2O 37 μl，置37℃過夜，取5μl進行1% 瓊脂糖凝膠電泳，用 TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(Code No.DV805A)切膠回收得目的基因片段。用BamHⅠ和HindⅢ對pET28a(+)載體進行酶切，反應體積 50 μl，組成如下:約 100 ng/μl的 pET28a(+)10 μl、10 ×K Buffer 5 μl、15 U/μl BamHⅠ 1.5 μl、15 U/μl Hind Ⅲ1.5 μl、dH2O 32 μl，置 37℃ 過夜，取5μl進行1% 瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收大片段，用TaKaRa DNA Ligation Kit將目的基因片段和pET28a(+)連接后，熱轉化至E.coli Competent Cells JM109，37℃培養過夜。挑取單個菌落，提取質粒后行瓊脂糖凝膠電泳，對目的質粒行BamHⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定，取10μl進行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.5 重組蛋白的誘導表達 取pET28a(+)-Der f 10陽性克隆 0.5μl轉化 Competent cell BL21(DE3)100μl，涂布于 LB平板 (LB/抗生素 Kana為50μl/450μl)上，37℃搖菌過夜，以 pET28a(+)vector進行同樣操作。次日挑取單菌落至2 ml LB/抗生素培養液中，37℃搖菌至OD600 nm值約為0.5 ～0.7，添加 IPTG 50 μl(final 1 mmol/L IPTG)，37℃誘導3小時后進行蛋白質抽提，分別取各抽提液(全蛋白、上清可溶性蛋白、沉淀的不溶性蛋白)10 μl，加入 2.5 μl 5 ×SDSsample buffer，95℃加熱10 分鐘，12.5 μl(約0.05 OD)上樣進行 SDSPAGE電泳，剩余樣品-80℃保存。電泳條件:20 mA/枚，90 分鐘，12%polyacrylamide gel，每孔加入5 μl TaKaRa protein marker(Broad)。電泳結束后，CBB-R250染40分鐘以上，使用脫色液脫色。

1.2.6 Western blot鑒定重組蛋白 按上述方法進行SDS-PAGE電泳，按陽極、濾紙 A、濾紙 B、PVDF膜、PAGE Gel、濾紙 C、陰極順序進行 Blot stack，將蛋白質轉移(Semi-dry Blot)到 PVDF膜。再將PVDF 膜置 10 ml Blocking buffer(1.5%BSA、20 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、0.1%Tween 20)中，4℃平放過夜封閉。用 Blocking buffer按1∶1 000 稀釋一抗(Penta-His Antibody，BSA free，QIAGEN)，取5 ml抗體溶液置PVDF膜上靜置1小時，洗滌 Buffer(150 mmol/L NaCl，20 mmol/l Tris-HCl)+0.1%Tween(20 ml)洗滌2次，洗滌 Buffer沖洗3次。使用Blocking Buffer按1∶1 000稀釋二抗［HRP-Rabbit Anti-Mouse IgG(H+L)，ZYMED］，取稀釋后抗體溶液5 ml置PVDF膜上1小時，同上法洗滌，同前法洗滌去除多余的抗體，用1 ml True-Blue Peroxidase Substrate顯色1分鐘。將PVDF膜置于水中終止反應。

1.3 生物信息學分析 將原始測序結果5'和3'端的酶切位點去除后，NCBI網站在線軟件進行ORF分析。用Translate工具推導編碼氨基酸的序列及理化性質，CELLO2.5軟件進行亞細胞定位，Finger-PRINTScan分析其模序特點。

2 結果

2.1 粉塵螨變應原Der f 10基因擴增結果 RNAiso Reagent試劑盒提取粉塵螨總RNA后，根據Gen-Bank公布的Der f 10核酸序列設計并合成引物，RT-PCR擴增獲得Der f 10，其產物經瓊脂糖凝膠電泳，見一條約888 bp的條帶，與理論值相符合(具體見圖1)。

圖1 粉塵螨變應原第10組分RT-PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Electrophoresis analysis of the RT-PCR product of the group 10 allergen of Dermatophagoides farinae

2.2 克隆質粒構建及酶切鑒定結果 將回收的PCR產物與pMD19-T simple連接后，轉化至E.coli Competent Cells JM109中，過夜培養，藍白斑篩選并提取8個質粒，用BamHⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定獲得與預期相符的結果，1.0%瓊脂糖凝膠電泳結果見圖2。

圖2 重組質粒p MD 19-T-Der f 10雙酶切鑒定電泳圖Fig.2 Enzyme digestion analysis of the recombinant plasmid p MD 19-T-Der f 10

圖3 原核表達質粒pET28a(+)-Der f 10酶切鑒定Fig.3 The enzyme digestion analysis of the plasmids pET28a(+)-Der f 10

2.3 核酸序列測定 從酶切鑒定正確的8個質粒中隨機挑取前5個質粒，使用引物Primer pMD18F/Primer pMD18R對陽性重組質粒測序，去除原始測序結果5'和3'端的酶切位點后，從起始密碼子ATG到終止密碼子TAA共888 bp，與參考序列(Accession Number EU106617)比對，序列同源性高達99.8%，有2處發生堿基突變，依次位于57 bp(T→C)和429 bp(T→A)，但并不引起氨基酸變化。

2.4 原核表達質粒pET28a(+)-Der f 10的構建及鑒定 用BamHⅠ/HindⅢ雙酶切pMD 19-T-Der f 10，回收后獲得目的基因，將其插入pET28a(+)載體，質粒提取后行瓊脂糖凝膠電泳，挑選目的質粒用BamHⅠ/HindⅢ進行酶切鑒定，經1%瓊脂糖凝膠電泳顯示出兩個條帶，與預期相符(見圖3)，說明原核表達質粒構建成功。

圖4 粉塵螨變應原第10組分原核表達及鑒定Fig.4 Expression of r Der f 10 in E.coli BL21 cells

2.5 重組變應原rDer f 10的表達及鑒定 將pET28a(+)-Der f 10質粒轉化宿主菌E.coli BL21，測定得吸光度值為0.614，誘導表達后吸光度值為0.993，SDS-PAGE電泳時出現特異性條帶;Western blot分析表明重組蛋白可與抗His-Tag Mab抗體結合，也出現一特異性的反應條帶，具體見圖4A、B。

2.6 氨基酸序列推導、蛋白質結構和功能預測 由測序結果推導Der f 10全長cDNA由295個氨基酸組成，相對分子質量為34 233.1 Da，摩爾消光系數(Molar extinction coefficient)5 960，等電點為 4.90;該蛋白的不穩定系數是44.71，表明該蛋白性質不穩定;其親水性指數(Grand average of hydropathicity，GRAVY)為 -1.063，表明其為疏水性蛋白。GOR4預測其二級結構包括 α-螺旋(271aa，91.86%)、延伸主鏈(4，1.36%)和無規卷曲(20，6.78%)，具體見圖5。將推導出來的氨基酸序列輸入FingerPRINTScan在線工具發現5個原肌球蛋白(Tropomyosin)模序，其分別位于 84～101、120～140、145～173、175～198和231～256氨基酸處。

3 討論

圖5 粉塵螨變應原第10組分二級結構分析(GOR4軟件)Fig.5 The secondary structure analysis of the group 10 allergen of Dermatophagoides farinae(GOR4 software)

特異性免疫治療被認為是目前惟一的哮喘病因治療方法，可以提高患者對特異性變應原的免疫耐受力，改變哮喘病程、阻滯癥狀的惡化和防治對新的變應原產生過敏［2-4］。目前，臨床主要采用粉塵螨變應原粗提浸液免疫治療哮喘患者，由于變應原浸液包含成分較復雜，如存在變應原、非過敏性或毒性蛋白及其它成分，所以很難進行變應原標準化，且在治療中長期使用易導致紅暈、腫脹、硬結、壞死等局部反應和休克、喉頭水腫、支氣管痙攣、蕁麻疹、血管性水腫、全身性紅斑等全身反應［2-4］。隨著分子生物學技術的發展和成熟，研制基因工程變應原成為變態反應學研究的主流。本次研究獲得了粉塵螨變應原第10組分全長基因，并成功構建其原核表達體系，為進一步生產重組變應原用于臨床診斷和治療奠定了基礎。

隨著功能基因組、基因芯片和蛋白質芯片技術迅猛發展，生物信息學分析已成為變態反應學研究的重要手段，尤其是用于變應原結構、模序及表位研究［8-10］。通過對Der f 10測序結果的生物信息學分析，提示此變應原由295個氨基酸組成的疏水性蛋白，相對分子質量為34 233.1 Da。功能位點分析發現Der f 10含有5個原肌球蛋白位點，提示此變應原與原肌球蛋白具有同源性。進一步的分析顯示，其二級結構包括 α-螺旋(91.86%)、延伸主鏈(1.36%)和無規卷曲(6.78%)。α-螺旋是指氨基酸鏈形成螺旋狀，4個氨基酸螺旋成一周，其在Der f 10二級結構占有絕對優勢，一定會對其三維結構具有重要作用，并在其與IgE抗體結合反應中發揮重要作用，因此有必要開展針對其二級結構的后續研究。

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