柯薩奇病毒B組3型亞單位疫苗與基因靶向疫苗免疫小鼠的效果比較①

高志云 藍佳明 金玉懷 李 劍 劉貴霞 羨 仙 張永紅 王永祥

(河北醫科大學病原生物學教研室，石家莊050017)

柯薩奇病毒 B組 3型(Coxsackievirus B3，CVB3)感染所致的病毒性心肌炎嚴重危害人類健康。自病原體確立以來，已開展大量疫苗研發工作，但并沒有獲得滿意的進展。研究顯示，CVB3衣殼蛋白1(Capsid protein1，VP1)是其主要的中和抗原，可誘導機體產生保護性免疫應答。

本室前期構建了原核表達質粒pET-his/VP1，證實表達VP1蛋白，并且將分泌型CVB3 VP1的基因和三拷貝C3d分子的基因拼接，構建成靶向B細胞的融合基因疫苗pcDNA3/C3d3-sVP1和rAd/C3d3-sVP1［1，2］。為篩選較好的候選疫苗，本研究將VP1蛋白、pcDNA3/C3d3-sVP1和 rAd/C3d3-sVP1分別免疫小鼠，通過觀察不同疫苗誘導的特異性免疫應答水平，以及病毒攻擊后的免疫保護作用來評價疫苗的免疫效果。

1 材料與方法

1.1 細胞、菌株和病毒株 人宮頸癌細胞系(He-La)細胞，本室保存;人胚腎293(HEK293)細胞購自中國醫學科學院基礎所細胞中心;大腸桿菌E.coli DH5α 和 BL21(DE3)pLysS，CVB3 Nancy株，本室保存。

1.2 質粒、重組腺病毒及實驗動物 原核表達質粒pET-his/VP1、真核表達質粒pcDNA3/C3d3-sVP1和重組腺病毒rAd/C3d3-sVP1，本室前期構建。6～8周齡雄性純系BALB/c小鼠購自河北醫科大學實驗動物中心。

1.3 試劑 各種工具酶購自美國Promega公司;腺病毒沉淀法純化試劑盒購自上海杰美基因醫藥科技有限公司;細胞計數試劑盒CCK-8購自日本同仁化學研究所?？笻is單克隆抗體(mAb)和辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠IgG購自北京中杉公司。其他試劑購自國內外生物公司。

1.4 質粒的大量提取與純化 將pcDNA3/C3d3-sVP1轉化感受態大腸桿菌DH5α，然后接種至2YT液體培養基(含氨芐青霉素)，于37℃振蕩培養過夜，收集菌體，按堿裂解法大量制備質粒，并用PEG法對之進行純化，定量后保存于-70℃備用。

1.5 重組腺病毒的大量擴增與純化 大量培養HEK293細胞，將第三代重組腺病毒rAd/C3d3-sVP1分別感染293細胞。當大部分細胞(約80%)出現細胞病變時，收集細胞，用腺病毒純化試劑盒純化。用GFP陽性細胞計數法測定病毒滴度，-70℃保存備用。

1.6 VP1蛋白的表達和純化 按參考文獻［3］方法，將表達CVB3VP1蛋白的重組質粒pET-his/VP1轉入感受態菌E.coli BL21(DE3)pLysS中，然后轉種于 LB液體培養基中，37℃培養至A600為0.6～0.8時，加IPTG至終濃度為1 mmol/L，于30℃誘導5小時。用超聲波裂解細菌，離心后收集包涵體沉淀，用Western blot鑒定蛋白。其余沉淀用尿素溶解，用Ni-NTA親和層析柱純化目的蛋白，透析后濃縮定量保存于-70℃備用。

1.7 免疫接種 6～8周齡雄性純系BALB/c小鼠隨機分為4組，每組18只，分別于股四頭肌注射PBS、pcDNA3/C3d3-sVP1、rAd/C3d3-sVP1 與 VP1蛋白。PBS組、pcDNA3/C3d3-sVP1質粒組與VP1蛋白組免疫3次，間隔3周;rAd/C3d3-sVP1腺病毒組免疫2次，間隔2周。質粒接種前注射25%高滲蔗糖溶液100μl，20分鐘后原位注射質粒100μg/100μl;重組腺病毒每次每只1.2×107pfu/100μl;PBS組每次每只注射100μl;VP1蛋白初次免疫加完全弗氏佐劑，加強免疫用不完全弗氏佐劑，每次每只接種50μg。

1.8 血清特異性IgG檢測 采用ELISA方法。每次接種后第14天內眥靜脈取血，分離血清。用純化的VP1蛋白包被96孔酶標板，洗滌后加入2倍系列稀釋的上述小鼠血清，每個稀釋度4復孔，同時設陰性和空白對照孔，37℃孵育2小時，洗滌后加辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠 IgG，再次洗滌后加TMB顯色。用酶標儀測450 nm吸光度(A)值。(試驗孔A450-空白對照孔A450)/(陰性對照孔A450-空白對照孔A450)≥2.1時判為陽性。以陽性孔最高血清稀釋度的倒數作為該血清IgG抗體滴度。

1.9 中和抗體檢測 采用微量中和試驗方法。取上述小鼠血清置56℃水浴30分鐘滅活，用 RPMI1640維持液(含青、鏈霉素各100 U/ml)稀釋成1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320，共 7 個稀釋度。將各稀釋度血清加入96孔板中，每個稀釋度4個復孔，每孔50μl。每孔加入100TCID50CVB3 50 μl，于37℃ 5%CO2孵育60分鐘。HeLa單層細胞經胰酶消化后，調濃度為5×108ml-1，每孔加入50μl。另設病毒對照孔、血清對照孔和細胞對照孔，于37℃ 5%CO2孵育，每日于倒置顯微鏡下觀察細胞病變效應。以能保護細胞不出現細胞病變的最高血清稀釋度的倒數作為該血清標本的中和抗體滴度。

1.10 特異性CTL檢測 末次免疫后3周，每組取3只小鼠處死，無菌取脾。將脾淋巴細胞用IL-2、ConA和滅活的CVB3體外刺激3天，作為效應細胞。用滅活的CVB3體外刺激1天的SP2/0細胞作為靶細胞。以效靶比為40∶1進行試驗，靶細胞以含10%新生牛血清的1640培養液稀釋至1×105ml-1，加入96孔板中，每孔100μl，每孔加入效應細胞100μl，同時加入IL-2、ConA和滅活的CVB3刺激，于37℃、5%CO2孵箱中培養24小時，采用CCK-8法檢測脾細胞殺傷活性，具體操作按說明書進行。同時設效應細胞孔和靶細胞孔各3復孔。殺傷率(%)=［1-(效靶A值-效應細胞A值)/靶細胞A值］×100%。

1.11 血中病毒滴度測定 末次免疫后3周，每組取3只小鼠，腹腔注射3LD50的CVB3。第7天取血后分離血清，用RPMI1640細胞維持液10倍系列稀釋，接種HeLa單層細胞，于37℃ 5%CO2條件下孵育并逐日觀察CPE，按Reed-Muench法計算病毒的滴度。

1.12 攻毒試驗 末次免疫后3周，小鼠腹腔注射含4LD50的 CVB3的病毒液0.2 ml/只，觀察各組小鼠的存活情況至感染后第21天。

1.13 統計學處理 用SPSS14.0統計軟件進行統計分析。小鼠中和抗體、血清特異性IgG抗體水平、CTL的殺傷率和病毒滴度的比較采用單因素方差分析，兩兩比較使用SNK檢驗;生存率和生存時間的比較分別采用卡方檢驗。

圖1 重組質粒pcDNA3/C3d3-sVP1的酶切電泳結果Fig.1 Digestion results of pcDNA3/C3d3-sVP1

2 結果

2.1 質粒pcDNA3/C3d3-sVP1的鑒定 大量制備的質粒經提純后酶切鑒定，除可見預期的特異性條帶外，未見其他非特異性條帶(圖1)。

2.2 重組腺病毒rAd/C3d3-sVP1的培養 重組腺病毒rAd/C3d3-sVP1感染293細胞后，用熒光顯微鏡可觀察到腺病毒增殖情況(圖2)。

2.3 VP1蛋白的鑒定 將純化后蛋白進行SDSPAGE，用His單抗作Western blot檢測顯示，相對分子質量在33 000左右有一條清晰的目的條帶(圖3)。

2.4 血清特異性IgG水平 結果顯示，除PBS組未檢測到VP1特異性IgG抗體外，其余各組IgG抗體滴度隨免疫次數的增加而提高(P＜0.05);末次免疫后各組比較，VP1蛋白組抗體滴度顯著高于pcDNA3/C3d3-sVP1和 rAd/C3d3-sVP1組(P ＜0.05)，提示3種疫苗均能誘導出較強的特異性抗體，但以VP1蛋白疫苗最為顯著(見表1)。

2.5 血清中和抗體水平 PBS組各次平均效價均低于1∶5，其余3組中和抗體滴度逐次增加(P＜0.05)。各組各次免疫后血清中和抗體平均滴度見表2。從表中可以看出，末次免疫后，VP1蛋白組的中和抗體滴度明顯高于pcDNA3/C3d3-sVP1組和rAd/C3d3-sVP1 組(P ＜0.05)。

圖2 熒光顯微鏡觀察重組腺病毒r Ad/C3d3-sVP1感染的HEK293細胞(×200)Fig.2 Fluorescence microscopy analysis of recombinant adenovirus r Ad/C3d3-sVP1 production(×200)

圖3 重組蛋白的Western blot檢測結果Fig.3 Western blot analysis of the purposing protein by His antiboby

表1 血清特異性VP1 IgG滴度(±s)Tab.1 Mean sera specific VP1 IgG titers±s)

表1 血清特異性VP1 IgG滴度(±s)Tab.1 Mean sera specific VP1 IgG titers±s)

Note:After the last immunization:compared with pcDNA3/C3d3-sVP1，1)P ＜0.05;compared with rAd/C3d3-sVP1，2)P ＜0.05.

Groups After first immunization After second immunization After third immunization pcDNA3/C3d3-sVP1 66.07 ±1.78 199.99 ±2.24 459.41 ±2.64 rAd/C3d3-sVP1 62.95 ±1.35 799.83 ±1.291)VP1 protein 398.84 ±1.32 20 995.62 ±1.681)2) 36 300.11 ±1.821)2)

表2 平均的中和抗體滴度±s)Tab.2 Mean neutralizing antibody titers(±s)

表2 平均的中和抗體滴度±s)Tab.2 Mean neutralizing antibody titers(±s)

Note:After the last immunization:compared with pcDNA3/C3d3-sVP1，1)P ＜0.05;compared with rAd/C3d3-sVP1，2)P ＜0.05.

Groups After first immunization After second immunization After third immunization pcDNA3/C3d3-sVP1 8.41 ±1.81 25.19 ±1.86 33.65 ±1.70 rAd/C3d3-sVP1 8.91 ±1.32 56.63 ±1.321)VP1 protein 8.91 ±1.31 47.86 ±1.37 70.79 ±1.311)2)

圖4 4LD50攻擊后小鼠生存曲線Fig.4 Survival curve of BALB/c mice challenged with 4LD50 CVB3

2.6 特異性CTL殺傷活性 當效靶比為40∶1時，小鼠脾臟特異性殺傷活性分別為:PBS組(24.53±4.65)%、pcDNA3/C3d3-sVP1 組(36.33 ±2.52)%、rAd/C3d3-sVP1組(67.31 ±2.54)% 和 VP1 組(47.39±4.01)%。結果顯示，各實驗組小鼠脾細胞CTL殺傷活性均高于PBS組(P＜0.05);rAd/C3d3-sVP1組高于pcDNA3/C3d3-sVP1組和VP1蛋白組(P ＜0.05)。

2.7 血中病毒滴度 與PBS對照組(5.67±0.15)相比，其余各組小鼠血中病毒滴度顯著降低(P＜0.01)，且 VP1 蛋白組(2.27 ±0.21)明顯低于 pcDNA3/C3d3-sVP1 組(2.98 ±0.66)和 rAd/C3d3-sVP1組(2.93±0.14)，提示VP1蛋白能顯著降低受感染小鼠血中的病毒含量。

2.8 小鼠保護率 小鼠在接種CVB3第3天起開始發病，第4天開始死亡。各組21天生存率分別為:pcDNA3/C3d3-sVP1 組 33.33%，rAd/C3d3-sVP1組27.78%，VP1組66.67%，PBS組無生存。根據各組小鼠存活的情況(圖4)，用Kaplan-Meier生存分析表明，3種疫苗都能明顯提高對病毒攻擊后小鼠的保護率，但VP1蛋白組生存狀況優于pcDNA3/C3d3-sVP1組和Ad/C3d3-sVP1組(P＜0.05)。

3 討論

C3d是補體C3不能水解的最小片段，能與B細胞等抗原提呈細胞細胞膜受體結合，促進通過MHCⅡ類途徑的抗原提呈。本室前期將3個片段的C3d(C3d3)與帶有IL-2信號肽的CVB3VP1基因拼接，構建靶向B細胞的分泌型核酸疫苗pcDNA3/C3d3-sVP1。其后，又利用AdEasy系統，構建包裝了重組腺病毒rAd/C3d3-sVP1。本研究將這二種疫苗進行比較，發現末次免疫后rAd/C3d3-sVP1能誘導出較強的特異性IgG抗體和中和抗體以及較高水平的脾臟淋巴細胞特異性CTL殺傷活性，明顯高于質粒載體疫苗pcDNA3/C3d3-sVP1組，但致死量病毒攻擊后小鼠生存率卻沒有顯著提高。推測與腺病毒疫苗主要傾向于CD8+T細胞介導的免疫應答有關［4］。當致死量病毒攻擊小鼠后，未被中和的病毒感染心肌細胞后，較強的CTL殺傷活性會加重心肌損傷，導致 rAd/C3d3-sVP1組小鼠生存率降低。Schirmbeck等［5］曾將乙肝病毒s基因構建到不同載體的疫苗免疫B淋巴細胞缺陷小鼠，發現腺病毒疫苗較核酸疫苗可以誘導更高更持久的CD8+T細胞免疫反應;Singh等［6］的研究也得出相同結論。T細胞分化的傾向對小鼠病毒性心肌炎發病起到很重要的作用，Henke等［7］研究發現用CVB3感染CD8+T細胞缺陷小鼠可以增加小鼠存活率，減少晚期嚴重病毒性心肌炎的發生，而感染CD4+T細胞缺陷小鼠雖發病時間推遲，但死亡率增加。故選擇合適的疫苗增強免疫后的體液免疫水平是CVB3疫苗的目標。

亞單位疫苗是利用蛋白質等抗原來誘導免疫應答的，不含感染性組分，無須滅活，也無致病性。本研究將原核表達質粒pET-his/VP1轉入大腸桿菌中表達CVB3 VP1蛋白，純化后免疫小鼠，結果顯示相對于另二種疫苗，VP1蛋白可誘導機體產生更高水平的特異性IgG抗體和中和抗體，顯著降低CVB3感染后小鼠血中病毒滴度，提高動物存活率和存活時間;提示亞單位疫苗VP1蛋白可誘導出較強的體液免疫，而在保護小鼠免受致死量病毒的攻擊時體液免疫可能發揮更重要作用。最近一些研究顯示［8］，通過抑制Th1類細胞增殖及其細胞因子的表達，增強了體液免疫應答，可明顯減輕CVB3感染小鼠的心肌炎癥，增加存活率。而Cihakova等［9］的研究從另一方面也得到類似的結論，通過敲除IL-4和IL-13基因的小鼠，減少了Th2類細胞因子產生，可導致效應T細胞活化減少，加重CVB3誘導的病毒性心肌炎。

本研究中發現三種基因工程疫苗雖然均能不同程度提高小鼠的細胞免疫和體液免疫功能，一定程度上保護免疫小鼠免受致死量CVB3攻擊，但VP1蛋白亞單位疫苗明顯優于靶向基因疫苗，為進一步研制高效預防CVB3感染的疫苗奠定了實驗基礎。

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7 Henke A，Huber S，Stelzner A et al.The role of CD8 T lymphocytes in coxsackievirus B3-induced myocarditis［J］.J Virol，1995;69(11):6720-6728.

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9 Cihakova D，Barin J G，Afanasyeva M et al.Interleukin-13 protects against experimental autoimmune myocarditis by regulating macrophage differentiation［J］.AJP，2008;172(5):1195-1208.