上海地區漢族人群中性粒細胞抗原的基因頻率與其分子特征研究①

朱傲雪 楊 穎 張嘉敏 楊啟修 高歡歡 朱自嚴

(上海市血液中心輸血研究所血型參比實驗室，上海200051)

人類中性粒細胞抗原(Human neutrophil antigens，HNA)是位于中性粒細胞膜上的多肽結構。目前已知有五類 HNA系統，分別是 HNA-1、HNA-2、HNA-3、HNA-4和 HNA-5，其抗原分別位于 CD16、CD177、膽堿轉運子樣蛋白2、CD11b 和CD11a 上［1，2］。

HNA同種抗體與多種臨床疾病相關，例如同種免疫新生兒中性粒細胞減少癥，自身免疫中性粒細胞減少癥和輸血相關性急性肺損傷(Transfusion-related acute lung injury，TRALI) 等［1］。其中 TRALI是在輸血過程中或輸血后6小時內發生的一種急性呼吸窘迫綜合征，嚴重者可引起死亡。大部分的TRALI，是由于輸注的血液制品中含有白細胞抗體(-HLA 和-HNA) 引 起 的［3］。HNA-1a、HNA-1b、HNA-2a、HNA-3a相應抗體都有可能引起TRALI，其中抗HNA-3a抗體最常見，尤其在致命性TRALI病例中［4］。因此了解HNA的分布及其分子特征，對于評估HNA同種抗體引起疾病的風險很重要。

本研究采用文獻已報道的引物，建立序列特異性引物聚合酶鏈反應(Polymerase chain reaction-sequence specific primer，PCR-SSP)作為主要檢測方法，對上海地區326份隨機健康獻血者樣本的HNA-1、3-5各系統進行基因型分析，利用測序或PCR-限制性片段長度多態性(PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)等方法進行分子特征分析;而HNA-2a抗原表達主要受轉錄剪切影響，無法采用以DNA為基礎的分析方法，因此我們另外隨機采集了同一地區91名健康獻血者的新鮮外周血，用流式細胞儀分析HNA-2a抗原表達情況。

1 材料與方法

1.1 研究對象 326份血樣和91份新鮮血樣均來自上海市血液中心職工或隨機健康獻血者，所有血樣均為EDTA抗凝的外周血，并獲取知情同意。

1.2 主要試劑及儀器 DNA提取試劑盒(北京天根公司);金牌酶(Applied Biosystems);限制性內切酶Bsp1286I(NEB);鼠源抗CD177單抗和FITC標記的鼠源抗CD16單抗均為美國BD公司產品;FITC標記的羊抗鼠IgG(H+L)抗體(Jackson Immuno Research);Gene Amp PCR System9700型PCR擴增儀(ABI新加坡公司);KUBOT3300臺式離心機(日本久保田公司);Tanon EPS 100穩壓穩流定時電泳儀(上海天能科技有限公司);Imagemaster VDS凝膠成像儀(美國法瑪西亞公司);FACScan流式細胞儀(美國BD Biosciences公司);引物合成、測序及克隆測序均委托上海生工公司完成。

1.3 方法

1.3.1 全血DNA抽提 使用天根全血DNA抽提試劑盒，根據說明書對326份隨機健康獻血者樣本進行基因組DNA的抽提。紫外分光光度計測DNA濃度及質量，A260/A280均在1.8左右，A260/A230均大于2，經計算，本實驗提取的基因組DNA濃度均在60 ng/μl左右，-20℃保存備用。

1.3.2 中國上海人群HNA-1、3-5各系統分析

1.3.2.1 PCR-SSP方法檢測樣本基因型 根據參考文獻［5-9］合成引物，具體序列及對應擴增產物片段預期大小見表1。在上述文獻基礎上，對PCR擴增體系和擴增條件均進行了調整。PCR擴增反應體系均為10 μl∶1 μl 10×PCR buffer，1μl 2 mmol/L dNTP，金牌酶 1 U，0.8 μl 25 mmol/L MgCl2，10 μmol/L上下游引物各 0.5 μl，10 μmol/L內參引物HGF、HGR 各 0.5 μl，DNA 模板 1 μl(約 60 ng)。HNA-1系統的PCR擴增反應條件:95℃變性8分鐘，反應擴增30個循環(94℃變性30秒，57℃復性50秒，72℃延伸30秒)，72℃保溫5分鐘。HNA-3-5系統的PCR擴增反應條件:95℃變性8分鐘，反應擴增10個循環(94℃變性30秒，64℃復性40秒，72℃延伸30秒)，反應擴增25個循環(94℃變性30秒，61℃復性30秒，72℃延伸30秒)，72℃保溫5分鐘。擴增產物于1.5%瓊脂糖凝膠中120 V電泳30分鐘，凝膠成像儀觀察結果。用以上方法對326份樣品進行HNA-1、3-5各系統的基因分型。

1.3.2.2 測序分析 HNA-1、HNA-3 和 HNA-4 系統挑選PCR-SSP結果分別為HNA-1a純合、HNA-1b純合、HNA-3a純合、HNA-3b純合、HNA-4a陽性純合的樣本各6份，進行測序分析和克隆測序。重新招募以上實驗樣本中具有HNA-1a純合和HNA-1b純合的本單位職工或獻血員，在獲取知情同意后采集新鮮外周血樣，采用參考文獻［10］的方法抽提RNA并進行逆轉錄PCR(Reverse transcription-PCR，RT-PCR)，擴增產物進行測序分析，并與上述測序、克隆測序結果進行比較分析。測序相關引物見表1。

1.3.2.3 PCR-RFLP方法分析 HNA-5系統 挑選PCR-SSP結果為HNA-5a陽性純合、HNA-5a陰性純合和HNA-5a雜合的樣本各2份，根據參考文獻［11］的方法進行檢測。引物序列見表1。

表1 實驗所用引物序列Tab.1 Primers used in this study

1.3.3 中國上海人群HNA-2系統的分析 根據參考文獻［12］的方法，制備中性粒細胞，使用鼠源抗CD177單抗作為一抗，FITC標記羊抗鼠IgG(H+L)抗體(1∶60稀釋)作為二抗，同時FITC標記的鼠源抗CD16單抗作為粒細胞標記平行對照，用流式細胞儀分析91份隨機健康新鮮樣本HNA-2a抗原表達情況，并使用CellQuest Pro軟件分析實驗結果。

1.4 統計學分析 采用率的計算公式［13］和基因計數法［14］分別計算HNA-1、3-5各系統的基因型頻率、基因頻率和流式細胞術分析得到的HNA-2a抗原頻率。應用 Haploview4.2軟件(可從 http://www.broadinstitute.org/scientific-community/science/programs/medical-and-population-genetics/haploview/downloads下載)進行Hardy-Weinberg平衡檢驗。根據參考文獻［7，9，15-18］對比3個不同地區人群的5類 HNA系統分布情況，采用統計學軟件SPSS13.0，使用 χ2檢驗及 Fisher's精確檢驗進行分析，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 PCR-SSP檢測結果 電泳結果見圖1。其中圖1A、1B和1C分別為HNA-1a引物、HNA-1b引物和HNA-1c引物對應的PCR擴增結果，可判斷出泳道1、2為 HNA-1a純合子，泳道3、4為 HNA-1a/1b雜合子，泳道5、6為HNA-1b純合子。圖1D和1E分別為HNA-3a引物、HNA-3b引物對應的PCR擴增結果，可判斷出泳道7、8、9為HNA-3a純合子，泳道10、11為HNA-3a/3b雜合子，泳道12為HNA-3b純合子。圖1F和1G分別為HNA-4a陽性引物、HNA-4a陰性引物對應的PCR擴增結果，可判斷出泳道 13、14、15、16、17、18 均為 HNA-4a 陽性純合子，未發現HNA-4a陰性等位基因。圖1H和1I分別為HNA-5a陽性引物和HNA-5a陰性引物對應PCR 擴增結果，可判斷出泳道19、20、21、22為HNA-5a陽性純合子，泳道23為HNA-5a雜合子，泳道24為HNA-5a陰性純合子。

2.2 測序結果 測序結果與PCR-SSP結果均為一致，HNA-1，3-4各系統結果見圖2。HNA-1a純合、HNA-1b純合樣本的PCR產物直接測序結果中出現雜合峰，干擾了結果判定，加用cDNA測序和克隆測序后，得到明確結果，且符合PCR-SSP結果。

圖2A是PCR-SSP結果為HNA-1a純合樣本的克隆測序結果，圖2B是PCR-SSP結果為HNA-1b純合樣本的克隆測序結果。可觀察到FCGR3B*01等位基因 (編碼 HNA-1a)與 FCGR3B*02(編碼HNA-1b)等位基因在編碼區域的5個SNP位點，分別為141位G/C，147位C/T，227位A/G，277位G/A，349 位 G/A，與 GenBank 序列 J0412、X16863一致。

圖2C和2D為HNA-1a/1b變異體的克隆測序結果，其中一個等位基因為正常FCGR3B*02等位基因，另一個等位基因為變異的FCGR3B*01等位基因(141G，147C，227G，277G，349A)。本研究發現2例這種類型的變異體。

圖1 PCR-SSP分析結果Fig.1 PCR-SSP amplification results

圖2 測序結果Fig.2 Sequencing results

圖2 E為HNA-1b/1b變異體的cDNA測序結果，該樣本為 HNA-1b 純合子，在141、147、227、349位點上與報道的FCGR3B*02等位基因相同，但在277位點上為G/A，兼具HNA-1a/1b特征，說明該HNA-1b純合子所攜帶的2個等位基因中的1個為變異的FCGR3B*02等位基因。本研究發現1例這種類型變異體。

圖3 PCR-RFLP結果Fig.3 Amplification results of PCR-RFLP

圖2F為PCR-SSP結果為HNA-3a純合樣本的測序結果，圖2G為PCR-SSP結果為HNA-3b純合樣本的測序結果。可觀察到HNA-3a/3b的多態性在于膽堿運輸子樣蛋白2基因461位G＞A的突變。

圖2H為PCR-SSP結果為HNA-4a陽性純合樣本的測序結果，測序結果表明ITGAM基因230位是G，與 GenBank序列 NM_000632一致。由于缺乏HNA-4a陰性樣本，本研究無法對ITGAM*230A等位基因進行測序分析。

2.3 PCR-RFLP結果 PCR-RFLP結果見圖3。泳道1為HNA-5a陽性純合子(136 bp和65 bp)，泳道2為HNA-5a雜合子(201、136和65 bp)，泳道3為HNA-5a陰性純合子(201 bp)。該結果與PCR-SSP的結果也吻合。

圖4 流式細胞術檢測HNA-2a抗原表達Fig.4 Flow Cytometry detecting the HNA-2a antigen expression on neutrophils

表2 中國上海地區漢族人群HNA分布情況以及與其他國家或地區人群的比較Tab.2 HNA distribution of Shanghai Han population and compared with populations in other countries or regions

2.4 流式細胞術檢測結果 流式結果見圖4，圖4 A為所選細胞，4B為與抗CD16單抗反應的細胞，用于確定所選的細胞群為中性粒細胞，4C和4D為與抗CD177單抗反應(用于指示HNA-2a抗原表達與否)的細胞，前者具有雙峰，雙峰分別對應指示CD177-、CD177+粒細胞，具有雙峰格局的在人群中的比例為94.5%(86/91)，其中CD177+粒細胞占30% ～70%為最多見;而4D為單峰，大部分粒細胞(＞90%)呈現CD177+，這組占人群比例約5.5%(5/91)。根據參考文獻［15］關于判定HNA-2a陽性的標準:與抗CD177抗體反應的中性粒細胞占總中性粒細胞5%以上者，視為HNA-2a陽性樣本，本研究確認91份樣本均為HNA-2a陽性。

2.5 統計學分析結果 統計結果見表2。經Haploview軟件進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，結果表明HNA-1-5各基因單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphism，SNP)位點均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)，具有群體代表性。中國上海人群與中國廣州人群相比，在HNA-3系統存在顯著差異(0.01＜P＜0.05)。中國上海人群與高加索人群在HNA1-5各系統上均存在非常顯著的差異(P＜0.01)。

3 討論

在不同國家和地區，HNA的分布情況會顯示出一定的差異。與廣州人群［15］和高加索人群［7，9，16-18］相比，本研究發現上海人群HNA-3b基因頻率要高。對于HNA-3b純合子的人群，如果有輸血史或妊娠史，可能會產生抗HNA-3a抗體，若將這些含有抗HNA-3a抗體的血液輸注給HNA-3a純合子的人群，可能會產生TRALI［4］。上海地區人群是不是具有更高TRALI發生風險，需要引起關注，可針對性在輸血前進行供體血液HNA同種抗體檢測，以排除潛在高危血液的輸注風險。這也是本研究的意義所在。

HNA-1抗原由位于1q23-24的FCGR3B編碼控制。其同種抗體據報道與同種免疫新生兒中性粒細胞減少癥、自身免疫中性粒細胞減少癥、TRALI有關［1］。FCGR3B 與 FCGR3A(編碼 FcγRIIIa)高度同源。FCGR3A在141、147和277位與FCGR3B*01相同，在227和349位與FCGR3B*02相同。因為FCGR3B與FCGR3A的高度同源性，本研究原先使用的HNA-1 PCR-SSP引物(借鑒參考文獻［19］)在實驗中出現了假陽性;而我們重新合成的新引物［5］則可克服此缺點。而且HNA-1采用普通PCR產物直接測序，測序結果也能受FCGR3A基因的干擾，在相應的位點出現雜合現象，而克隆測序和cDNA為模板的測序方法可有效去除FCGR3A序列的影響。

FCGR3B*01等位基因 (編碼 HNA-1a)與FCGR3B*02(編碼HNA-1b)等位基因在編碼區域有5個堿基不同，1a和1b分別對應141位G/C，147位 C/T，227 位 A/G，277 位 G/A，349 位 G/A［20-23］。目前已有數種FCGR3B序列變異體被描述［24］，這些嵌合的等位基因大部分帶有單堿基替換，大部分為上述5個SNP位點中的一個。本實驗發現3例FCGR3B的變異體，其中2例為HNA-1a/1b樣本FCGR3B*01等位基因發生227 A→G和349 G→A的突變，另1例為HNA-1b/1b樣本一條染色體在FCGR3B*02等位基因發生了277 A→G的突變，而另一條染色體上的FCGR3B*02序列是正常的，導致該樣本在FCGR3B*02序列277位呈現雜合(G/A)狀態，這3例變異體的攜帶者身體健康。

HNA-2a是一種高頻抗原。HNA-2系統同種抗體與同種免疫新生兒中性粒細胞減少癥、自身免疫中性粒細胞減少癥、TRALI、藥物誘發中性粒細胞減少癥、骨髓移植后移植物被排斥有關［1］。因為這個系統多態性的機制發生于轉錄剪切中，檢材要求較高，需要新鮮的細胞，陳舊血液和DNA樣品不能作為分析模板。目前在HNA-2a系統中已檢測出NB1和PRV-1兩個等位基因，它們cDNA序列之間有4個堿基不同，其中最常見的外顯子1第42位G＞C的SNP位點也許和HNA-2抗原的表達水平有關［12］，本研究也證實了上海地區人群呈現出2種格局HNA-2抗原的表達水平，這種差異表達是否也和這些SNP位點相關及差異表達的意義，擬在后續研究中詳細探討。

HNA-4a是一種高頻抗原，在不同的種族中的頻率都很高。但由于研究樣本量的限制，本文中326個樣本均為HNA-4a陽性，未發現HNA-4a陰性樣本。HNA-5a也是一種高頻抗原，現在關于HNA-5系統在臨床上的功能還尚未清楚。所以無法預測HNA-5系統在不同人群中的分布差異引起的臨床意義。

中國是一個多民族多人口的國家，有自己獨特的HNA分布情況。通過這次對中國人群HNA系統分布調查，我們發現絕大部分的結果與其他國家的數據資料有區別，甚至在不同地區也有差異。因此，需要填補我國在此方面的數據空白，提高臨床輸血的安全性，因此進一步地研究HNA及其相關領域對于我國今后的臨床輸血安全具有重要的意義。

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