煙草NtRAX基因的克隆和序列分析

高曉明，張澤坤，王衛鋒，劉貫山，李鳳霞，崔萌萌，孫玉合*

（1.農業部煙草生物學與加工重點實驗室，中國農業科學院煙草研究所，青島 266101；2.青島農業大學，青島 266109）

煙株上腋芽的存在，會消耗大量養分，嚴重影響煙葉的產量和品質[1]。煙草中，已經獲得與腋芽分生組織形成相關基因NtLS，該基因與擬南芥中控制腋芽分生組織形成的LAS基因高度相似[2]，對該基因進行 RNA干擾研究，所獲得的轉基因煙草植株，在腋芽的發生方面與野生型相比沒有明顯的區別[3]。LAS和RAX是兩條相對獨立的調控途徑，但是在功能上可能存在互補[4-5]。擬南芥中，現已發現RAX1、RAX2、RAX3基因，同屬于MYB基因家族。MYB基因家族是植物最大的轉錄因子家族之一，現有研究表明，植物MYB轉錄因子在植物器官形成、植物葉片的形態建成及抗病中起重要作用[6]，其途徑之一包括調節腋芽分生組織的形成[7]。擬南芥中，RAX基因控制腋芽分生組織形成的非常早期的一步。RAX突變株沿莖軸側芽形成有缺陷。RAX基因在功能上的冗余，對擬南芥次生軸的形成產生微調。其中，RAX1、RAX3基因在腋芽中心組織表達量較高[8]。

本研究通過在GenBank中尋找擬南芥RAX基因相關序列，通過同源比對，采用RACE技術，克隆獲得普通煙草中與RAX基因高度相似的基因，目的是為研究該基因的功能奠定基礎，進而為通過分子手段解決煙草腋芽問題奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試煙草品種為K326。2010年冬，在溫室內播種，自然光照條件下生長至營養生長期。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和檢測 取煙草K326幼嫩葉片為材料，Trizol法提取幼嫩葉片的總RNA。1×TBE緩沖液，1%瓊脂糖凝膠，電泳檢測總RNA。

1.2.2 反轉錄獲得cDNA 以總RNA為模板，按照PrimeScriptTM RT-PCR Kit的說明書進行。

1.2.3NtRAX中間片段的獲得 以 NCBI的擬南芥AtRAX2基因的序列（NM_129245.2）為信息探針，在煙草EST數據庫中進行Blastp檢索，獲得若干與之同源性較高的蛋白質序列。選取與e值最低的蛋白質序列對應的核酸序列（471 bp）為參照，設計引物，RAX-1：GAAGACAGAGTCATTTGTAGCC；RAX-2：ATTTGGAGTAGAGGGGAAG，以cDNA模板，進行PCR擴增，對400 bp附近的條帶回收并測序。

1.2.4NtRAX末端 cDNA第一鏈的合成 3′RACE和5′末端第一鏈cDNA的合成，分別以提取的RNA為模板，按照Invitrogen的Generacer試劑盒說明書進行。

1.2.5 3′末端片段的擴增 用已經獲得并測序驗證的404 bp大小的中間片段為模板鏈，設計2條末端擴增引物：

3race-GSP1：CCAGTTACCAGGCAGGACAGACAATG；

3race-GSP2：TGAAGGCGGAGGAAAGCCAATGAATG；

按照Generacer試劑盒說明書配制PCR擴增體系。反應程序如下：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，66 ℃，30 s，72 ℃，2 min，5個循環；94 ℃，30 s，65 ℃，30 s，72 ℃，2 min，5個循環；94 ℃，30 s，64 ℃，30 s，72 ℃，2 min，5個循環；94 ℃，30 s，62 ℃，30 s，72 ℃，2min，5 個循環；72 ℃，10 min，4 ℃，HOLD。

1.2.6 5′末端片段的擴增 用已經獲得并測序驗證的404 bp大小的中間片段為模板鏈，設計2條末端擴增引物：

5race-GSP1：TCATTGTCTGTCCTGCCTGGTAACTGG；

5race-GSP2：CCATTTCCATTCATTGGCTTTCCTCCG；

按照Generacer試劑盒說明書配制PCR擴增體系。反應程序如下：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，68 ℃，30 s，72 ℃，2 min，5 個循環；94 ℃，30 s，66 ℃，30 s，72 ℃，2 min，5 個循環；94 ℃，30 s，64 ℃，30 s，72 ℃，2 min，5 個循環；94 ℃，30 s，62 ℃，30 s，72 ℃，2 min，5 個循環；72 ℃，10 min，4℃，HOLD。

1.2.7 PCR產物的回收、連接及測序 1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下切膠，按照康為世紀瓊脂糖凝膠產物回收試劑盒說明書進行凝膠回收。將回收產物與pMD18-T載體連接，轉化TOP10E.coil感受態細胞，進行藍白斑篩選，挑取白斑進行菌落PCR鑒定后，選擇陽性克隆搖菌并測序。

1.3 序列分析

采用 ContingExpress軟件進行序列的拼接組裝；NCBI的ORF finder預測開放閱讀框；用NCBI的BLASTn序列比對工具進行同源性比對；蛋白質的等電點和分子量計算，采用 ExPASy網站的Compute PI/Mw tool；Pfam在線(http://pfam.sanger.ac.uk/)進行序列保守功能區的分析；采用 Clustalx軟件進行多序列比對；以序列比對的結果為基礎，利用MEGA5.0軟件構建系統進化樹。

2 結 果

2.1 NtRAX中間片段的獲得

以cDNA為模板，RAX-1和RAX-2為引物，擴增獲得一條 400 bp附近片段。經測序驗證，共404 bp。

2.2 NtRAX全長基因的獲得

通過3′末端擴增，獲得了723 bp的3′末端，該末端有24個堿基的PolyA尾巴，表明獲得了完整的3′端編碼序列。通過5′末端擴增，獲得了407 bp的5′末端，在起始密碼子ATG 42 bp前有一個終止密碼子TAG，表明獲得了完整的5′端編碼序列。

2.3 NtRAX基因的序列分析

使用contingExpress軟件對382 bp的5′RACE序列、418 bp的3′RACE序列和404 bp的中間序列進行拼接，獲得長度為1112 bp的全長基因cDNA序列。該序列全長 1112 bp，含有 429個腺嘌呤（38.6%）、179個胞嘧啶（16.1%）、293個鳥嘌呤（19.0%）、293個胸腺嘧啶（26.3%）。

對該序列進行ORF分析，得出該序列5′端非編碼區長度為96 bp，編碼區長度為954 bp，3′端非編碼區長度為62 bp，其中編碼區編碼317個氨基酸（圖1）。將該基因命名為NtRAX（NCBI登錄號為JQ228591）。

圖1 NtRAX的cDNA和蛋白質全長序列Fig.1 Full-length sequences of NtRAX cDNA and protein

將獲得的NtRAX基因的 cDNA序列在 NCBI上進行 BLAST分析，發現該序列與已有的番茄cDNA文庫中的單個克隆（LEFL1032AE06）部分序列相似性為74%，E值為0.0；與擬南芥RAX2基因的序列（NM_129245）相似性為 80%，E值為9e-86。

用ExPASy網站的Compute PI/Mw tool分析得到NtRAX基因所編碼的蛋白質的等電點為7.02，分子量為35.42 KDa。在線進行保守區域分析，結果表明，該蛋白在N端分別含有由52個和49個氨基酸組成的兩個MYB結構域，并且每個結構域含有典型的MYB轉錄因子所特有的保守的色氨酸殘基W（圖2），說明所克隆的NtRAX基因是MYB基因家族成員。

圖2 NtRAX的保守結構域Fig.2 Conserved domains of NtRAX

采用 Clustalx軟件對來自擬南芥的AtRAX1、AtRAX2、AtRAX3，來自大豆的GmMYB12a、GmMYB12B2、GmMYBJ6、GmMYBJ7、GmMYBZ1、GmMYBZ2，來自楊樹的PeMYBF1、PeMYBL1進行多序列比對（圖3）。由圖3分析，NtRAX蛋白功能與AtRAX具有較高同源性，推測NtRAX具有調節腋芽分生組織形成功能。采用MEGA5軟件分析繪制系統進化樹（圖4）。由進化樹可以看出，NtRAX和GmMYBJ7的進化關系最近，推測NtRAX是具有轉錄激活活性的MYB家族基因。

3 討 論

MYB類轉錄因子以保守的MYB結構域為共同特征。MYB結構域是一段約51～53個氨基酸的肽段，每個結構域含有3個保守的色氨酸殘基(W)[9]，分別被18～19個氨基酸殘基隔開，折疊成螺旋－轉角－螺旋結構，組成1個疏水核心。按照含有的MYB結構域的數量，MYB轉錄因子可分成 R1、R2R3、R1R2R3三個家族[9]。MYB轉錄因子主要參與生物的生長、發育和抗脅迫等方面的調節[10]。絕大多數MYB轉錄因子在植物代謝調控中起轉錄激活作用，也有少量起轉錄抑制作用[11-13]。

圖3 NtRAX蛋白與其他MYB蛋白多重比對Fig.3 Multi-alignment of NtRAX and other MYB proteins

圖4 煙草、擬南芥、大豆、楊樹的部分MYB基因系統進化樹Fig.4 A phylogenetic tree of MYB gene from Nicotiana tabacum, Arabidopsis, Glycine max and Populus euramericana

本研究克隆獲得了NtRAX基因，對新基因功能的預測，主要是通過同源比對，利用同源基因的功能來推測，得出NtRAX基因是具有轉錄激活活性的煙草腋芽分生組織形成的調控基因。該基因的功能，還應在后續試驗中不斷驗證。

本試驗中煙草品種選擇了作為常規對照的品種 K326，所取組織為幼嫩葉片。從研究腋芽基因的角度考慮，有以下想法，可在將來的試驗中進一步研究：（1）選擇腋芽多發的煙草品種。不同品種的煙草有其獨特的生物學表現，腋芽多發品種中相關基因的存在與表達情況是否與常規品種一致。（2）選擇煙草植株不同組織，研究相關基因在不同組織的表達情況。（3）對煙草植株進行打頂處理，研究打頂前和打頂后不同組織相關基因的表達情況。

4 結 論

本研究運用RACE方法克隆得到了煙草腋芽基因NtRAX，NCBI登錄號為JQ228591，該基因全長1112 bp，編碼區954 bp，編碼317個氨基酸，同源性分析表明，NtRAX屬于MYB基因家族。MYB家族蛋白是一類轉錄因子，因此，NtRAX基因編碼的產物可能通過與相關的轉錄調節因子結合，激活和促進腋芽的生長。NtRAX基因的克隆，為進一步研究煙草腋芽，從分子角度對腋芽的發生進行干擾奠定了基礎。

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