貴州黔南煙草馬鈴薯Y病毒（PVY）株系的血清學(xué)鑒定

羅紅香，李余湘，劉會(huì)忠，徐明勇，王林玉，趙中匯，何玉安，李章海，江 彤

（1.貴州省黔南州煙草公司，貴州 都勻 558000；2.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)煙草研究中心，合肥 230051；3.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植保學(xué)院，合肥 230036）

馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）是馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）的典型成員，能侵染煙草、馬鈴薯、番茄和辣椒等多種茄科作物[1]。根據(jù)PVY的鑒別寄主癥狀反應(yīng)和血清學(xué)反應(yīng)類型，進(jìn)一步將其劃分為多個(gè)株系，常見的有PVYO、PVYN和PVYC等株系。PVYO在不同馬鈴薯品種上引起輕重不一的花葉，而在煙草上引起斑駁和花葉；PVYN在馬鈴薯上一般表現(xiàn)為葉片無癥或輕型斑駁，而在煙草上引起葉脈和葉柄壞死；PVYC在馬鈴薯栽培品種上引起條痕花葉癥狀[2-3]。

我國植病工作者在上世紀(jì) 90年代以來也做過一些PVY株系鑒定工作。吳元華等[4]鑒定東北煙區(qū)煙草上發(fā)生的 PVY有普通株系（PVYO）、脈壞死株系（PVYVN）、點(diǎn)刻條斑株系（PVYC）和莖壞死株系（PVYNS）4個(gè)株系。王勁波等[5]鑒定山東煙區(qū)主要有PVYO和PVYN2個(gè)株系。江彤等[6]鑒定安徽煙草可能存在PVYO株系和PVYNTN株系。由于PVY不同株系發(fā)生復(fù)合侵染以及不斷發(fā)現(xiàn)新的PVY株系和亞株系，PVY株系的鑒定變得越來越復(fù)雜。PVY侵染煙草引起的馬鈴薯Y病毒病在國內(nèi)煙區(qū)廣泛分布[7-8]，特別在東北煙區(qū)和黃淮煙區(qū)危害嚴(yán)重[9-10]，大幅度降低煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量，成為阻礙煙葉生產(chǎn)的瓶頸。近年來，貴州省煙草馬鈴薯Y病毒也呈現(xiàn)逐年加重趨勢，特別是黔南煙區(qū) PVY大面積流行，在局部地區(qū)甚至造成毀滅性損失[11]。

為減輕貴州黔南煙草病毒病危害，摸清當(dāng)前貴州黔南煙區(qū)馬鈴薯Y病毒病發(fā)生發(fā)展的變化趨勢，鑒定黔南煙區(qū) PVY株系已成為當(dāng)務(wù)之急。本研究采用以 Tas-ELISA為主的血清學(xué)檢測手段來鑒定PVY株系，血清學(xué)鑒定方法較快速且可短時(shí)間鑒定大量樣本，因此，利用血清學(xué)方法加強(qiáng)對黔南煙草上 PVY的株系變化進(jìn)行系統(tǒng)鑒定和檢測，明確黔南煙草 PVY株系的分布，將為選育適合黔南煙區(qū)PVY重病區(qū)種植的抗病品種以及制定煙草PVY的防治措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病樣來源 2010年從貴州省黔南州甕安、福泉、貴定、龍里4個(gè)縣煙草產(chǎn)區(qū)共采集201個(gè)表現(xiàn)明顯馬鈴薯Y病毒病癥狀的煙草樣本。樣本表現(xiàn)為葉脈壞死、葉緣縱向下卷、葉片葉面皺縮、脈間輕花葉、矮化等癥狀。其中甕安縣珠藏鎮(zhèn)、牛場壩鄉(xiāng)；福泉縣龍昌鎮(zhèn)；貴定縣新浦鄉(xiāng)、新巴鎮(zhèn)；龍里縣巴江鄉(xiāng)、洗馬鎮(zhèn)的樣本數(shù)分別為34、28、36、44、7、27、25個(gè)。

1.1.2 試劑 馬鈴薯 Y 病毒各個(gè)株系診斷試劑：Potato Virus Y necrotic strain Reagent Set，Potato Virus Y strain C Reagent Set，Potato Virus Y strains O and C Reagent Set（美國Agdia公司）；堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG（Promega公司）；硝基苯磷酸酯鈉鹽（Sigma公司）；96孔酶標(biāo)板（美國Corning公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

Tas-ELISA檢測方法參照Agdia公司馬鈴薯Y病毒各個(gè)株系診斷試劑使用說明并略加調(diào)整。PVY多克隆抗體1:200稀釋后分別包被酶標(biāo)板，4 ℃孵育過夜；加入1:10稀釋的病汁液樣品，25 ℃孵育2 h；加酶標(biāo)記物稀釋液（含A酶標(biāo)抗體和B酶標(biāo)抗體），25 ℃孵育2 h；硝基苯磷酸酯鈉鹽（PNP）顯色，25 ℃孵育1 h，酶標(biāo)儀測定吸光值（OD405）。每步用含吐溫的磷酸鹽緩沖液（PBST）洗滌3～5次，測定時(shí)每個(gè)樣品均設(shè)2次重復(fù)。

2 結(jié) 果

黔南州甕安、福泉、貴定、龍里4縣201個(gè)煙草樣本的ELISA檢測結(jié)果見表1。從表1可看出，201個(gè)樣本中，共檢測出171個(gè)樣本受到PVY侵染，陽性率為85.1%。其中甕安、福泉、貴定、龍里PVY的陽性率分別為88.7%、75.0%、80.4%、92.3%。

171個(gè)受PVY侵染的樣本中，PVYN37個(gè)，占21.6%；PVYO133個(gè)，占77.8%；PVYC0個(gè)，PVYN和 PVYO復(fù)合侵染 1個(gè)，占 0.6%。其中，甕安縣55個(gè)陽性樣本全部是PVYO，占100%；福泉縣27個(gè)陽性樣本中，PVYN占11.1% ，PVYO占88.9%；貴定縣 41個(gè)陽性樣本中，PVYN占 34.1%，PVYO占65.9%；龍里縣48個(gè)陽性樣本中，PVYN占41.7%，PVYO占56.3%，PVYN和PVYO復(fù)合侵染占2.1%。侵染黔南州煙草的 PVY株系分布具有一定規(guī)律，PVYO在4縣分布均為主要株系，PVYN侵染相對較少，為次要株系，所有樣本均沒有檢測到PVYC侵染，復(fù)合侵染零星發(fā)生。

表1 貴州省黔南州201個(gè)煙草樣本的PVY株系鑒定結(jié)果Table 1 The results of ELISA detection of 201 of tobacco samples from Qannan, Guizhou

3 討 論

從貴州省黔南州甕安、福泉、貴定、龍里4縣采集煙草樣本時(shí)發(fā)現(xiàn)，黔南煙區(qū)疑似感染 PVY的煙株普遍表現(xiàn)為葉脈壞死、葉緣縱向下卷、葉片葉面皺縮、脈間輕花葉、矮化等癥狀。ELISA檢測進(jìn)一步證明，葉片背面支脈壞死的煙株基本都能檢測到 PVY的侵染，但 PVY在煙草上的癥狀表型與PVY株系之間沒有明確的關(guān)系，無論 PVYN還是PVYO都在煙草上表現(xiàn)出葉脈壞死癥狀。因此，根據(jù)脈壞死癥狀僅可以初步診斷煙株受到PVY侵染，但無法確定 PVY的株系，必須進(jìn)一步通過血清學(xué)檢測才可以明確PVY的株系類型。

本試驗(yàn)采用 Tas-ELISA檢測了黔南煙草 PVY的3個(gè)株系PVYN、PVYO和PVYC，發(fā)現(xiàn)侵染黔南煙草的PVY以PVYO為主，PVYN為次要株系。黔南 PVY株系分布在該地區(qū)具有一定規(guī)律，甕安縣位于黔南州的最北部，感染甕安煙草的 PVY樣本全部是PVYO，沒有檢測到PVYN侵染；福泉縣位于甕安縣南部，該縣煙草樣本以PVYO侵染為主，也能檢測到少量PVYN侵染。貴定縣的新浦鄉(xiāng)、新巴鎮(zhèn)以及龍里縣的巴江鄉(xiāng)、洗馬鎮(zhèn)相距不遠(yuǎn)，位于黔南州的西部。總體上，這4個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)煙草樣本仍然以 PVYO侵染為主，但龍里縣巴江鄉(xiāng)煙草樣本以PVYN侵染為主，占66.7%（數(shù)據(jù)未列出），與其他地方PVYO為優(yōu)勢株系有差異。貴定縣新巴鎮(zhèn)煙草PVY發(fā)病很輕，田間病株率低于1%（數(shù)據(jù)未列出），可能與該鎮(zhèn)處于相對較封閉的山區(qū)，高帶毒率的介體蚜蟲尚沒有大量遷入有關(guān)。

筆者在黔南州采樣時(shí)，也做了PVY病情普查。甕安縣PVY發(fā)病最為嚴(yán)重，發(fā)病田塊病株率30%～70%（數(shù)據(jù)未列出）不等，病情特別嚴(yán)重田塊呈枯黃一片，后期無法控制，煙農(nóng)甚至棄烤。有的煙農(nóng)因?yàn)轳R鈴薯 Y病毒病損失巨大，不愿意再種植烤煙，PVY造成的危害和損失在黔南煙區(qū)已成為烤煙生產(chǎn)瓶頸。因此，明確黔南煙草 PVY株系分布，為篩選出適合黔南煙草 PVY重病區(qū)種植的抗病品種具有重要意義。鑒于黔南煙區(qū)以PVYO為優(yōu)勢株系，進(jìn)行地方性品種抗病性選育時(shí)，就應(yīng)該選擇PVYO作為接種毒源。另外，黔南PVY株系種類可能隨蚜蟲的遷飛或烤煙品種的改變發(fā)生變化，因此，還需要繼續(xù)監(jiān)測黔南煙草PVY株系的變化。

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