半制備液相法紅松樹皮多酚物質分離技術的研究

黃雨洋，王振宇

（1.東北林業大學 林學院，哈爾濱 150040；2.哈爾濱工業大學 食品科學與工程學院，哈爾濱 150090；3.黑龍江糧食職業學院，哈爾濱 150080）

紅松（Pinus koraiensis）亦稱果松、海松。常綠喬木，高達40m，葉五針一束，長6～12cm。球果卵狀圓錐形，種子大無翅。紅松種子長1.2～1.6cm，子葉13至16枚。紅松是主要分布于我國東北小興安嶺地區，是重要的農林資源［1－2］。

常與魚鱗松、紅皮云杉等組成混交林。耐旱性強，喜微酸性或中性土，針葉及球果中含有抗氧化活性成分，種子可食，入藥后具有祛風除濕、滋養補虛的功效。

近年來，天然抗氧化劑的研究備受關注，其中多酚類是主要的抗氧化活性成分之一，松多酚即是此多酚類的成分之一，具有抗氧化、抗腫瘤及抗菌等多種生物活性［3－4］。研究表明，紅松樹皮中含有大量的多酚物質，為紅松樹皮的綜合利用、變廢為寶提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

紅松樹皮 采于小興安嶺；甲醇美國TEDIA天地試劑公司，HPLC；三氟乙酸TFA北京迪馬科技有限公司，HPLC；去離子水水 杭州娃哈哈有限公司，分析純。

1.2 實驗儀器

制備型高效液相色譜儀 北京創新通恒科技有限公司；超聲儀；天津泰斯特儀器公司；AB54型電子天平；梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；0.45μm微孔濾膜；北京化工二廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 工藝流程

紅松樹皮→乙醇提取［5］→大孔吸附樹脂AB－8（梯度洗脫→選取40%的洗脫→二級純化（制備型高效液相色譜儀）→各種因素進行對比→結果

1.3.2 紅松多酚的一級純化

首先對大孔吸附樹脂AB－8進行預處理：乙醇中浸泡AB－8大孔樹脂24h，待其充分溶脹后用蒸餾水反復洗滌，除去樹脂表面的殘留乙醇至無白色渾濁物出現。然后用8%鹽酸浸泡10h，用蒸餾水反復沖洗，用試紙測其pH7.0停止，再用5%氫氧化鈉溶液浸泡10h，在用蒸餾水反復沖洗至中性、裝柱。用大孔吸附樹脂AB－8進行梯度洗脫（20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇）對紅松多酚進行一級純化，由于實驗時間的原因，本實驗采用40%乙醇洗脫液用半制備型液相進行了二次純化。

1.3.3 半制備液相色譜法二級純化紅松多酚

1.3.3.1 紅松多酚樣品的配制。取0.1g經 AB－8型大孔樹脂40%乙醇洗脫液的一級純化凍干粉末溶解于10mL的甲醇溶液中，用0.45μm微孔濾膜過濾備用。

1.3.3.2 半制備液相的色譜條件。色譜柱為北京創新 Daisogel C18－10u100A，P3000 高 壓 輸 液 泵，UV3000可變波長檢測器，柱溫25℃下，流量分別為6、8、10mL／min，在紫外線波長分別為280、290、300、308、320、330、340nm下進行，上樣量分別為0.25、0.5、0.75、1.0mL，并且在不同的濃度洗脫當中進行分離。

1.3.3.3 試驗操作步驟。流動相采用A和B兩種，溶劑A：甲醇并混入0.02%三氟乙酸（TFA），溶劑B：去離子水中混入0.02%TFA。溶劑梯度體積比例跟實驗要求設定。首先，設定波長、流速，用100%的甲醇對柱子進行清洗。此后采用相同的紫外線波長和流速走基線，流動相采用不同的非線性濃度梯度的混合溶劑洗滌，直至基線平穩方可進樣。在出現比較的色譜峰是收集樣品，之后清洗色譜柱子。

1.3.3.4 觀測結果。根據半制備液相色譜峰型的高低，寬窄，面積，出峰時間可相對比較大致得出析出物質的含量多少，面積較大者則意味著析出物質的含量相對較多，從而可根據不同的因素條件對應的不同峰型面積得出析出該種物質含量最多的最佳各因素條件。

1.3.3.5 最佳工藝條件的研究

（1）流速對出峰面積的影響。在紫外線波長為308nm時，選取進樣量為2針（即為0.5mL），采用溶劑梯度體積比例如下0～10min，0A／100B；10～40min，20A／80B；40～50min，60A／40B；50～60min，65A／35B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B，在相同的外界環境下，分別選取流速為6、8、10mL／min進行試驗。選取一流速后1.3.3.4的操作流程獲取峰型圖。

（2）進樣量對出峰面積的影響。在紫外線波長為308nm，流速為8mL／min時，采用溶劑梯度體積比例如下0～10min，0A／100B；10～40min，20A／80B；40～50min，60A／40B；50～60min，65A／35B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B，在相同的外界環境下，分別選取進樣量為1針（0.25mL），2針（0.50mL），3針（0.75mL），4針（1.00mL）進行試驗。選取一進樣量后1.3.3.4的操作流程獲取峰型圖。

（3）紫外線波長對出峰面積的影響。在流速為8mL／min，進樣量為1針（0.25mL）時，采用溶劑梯度體積比例如下0～10min，0A／100B；10～40min，20A／80B；40～50min，60A／40B；50～60min，65A／35B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B，在相同的外界環境下，分別選取紫外線波長為280、290、300、308、310、320、330、340nm進行試驗。選取一紫外線波長后按1.3.3.4的操作流程獲取峰型圖。

（4）濃度洗脫對出峰面積的影響。在流速為8mL／min，進樣量為1針（0.25mL），在紫外線波長為308nm時，在相同的外界環境下，分別選取濃度洗脫：①0～10min，0A／100B；10～40min，20A／80B；40～50min，60A／40B；50～60min，65A／35B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B。②0～10min，0A／100B；10～20min，20A／80B；20～30min，40A／60B；30～40min，60A／40B；40～50min，80A／20B；50～60min，100A／0B；60～90min，100A／0B。③0～10min，0A／100B；10～40min，10A／90B；40～50min，50A／50B；50～60min，70A／30B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B。④0～10min，0A／100B；10～40min，10A／90B；40～50min，60A／40B；50～60min，70A／30B；60～65min，90A／10B；65～100min，100A／0B。⑤0～10min，0A／100B；10～40min，20A／80B；40～50min，50A／50B；50～60min，70A／30B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B進行試驗。選取一紫外線波長后按2.3.2.4的操作流程獲取峰型圖。

2 結果與分析

2.1 流速對出峰面積的影響

以下試驗均進樣兩針（0.5mL），紫外線波長為308nm，濃度洗脫為0～10min，0A／100B；10～40min，20A／80B；40～50min，60A／40B；50～60min，65A／35B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B。

（1）流速為6mL／min

圖1 色譜圖

（2）流速為8mL／min

圖2 色譜圖

（3）流速為10mL／min

圖3 色譜圖

由圖1～3可知在流速為6mL／min時，在77min時出現較大幅度的亂峰可能會導致析出的樣品不夠純正含有雜質或含有多種未知物質，此圖不能準確反映紅松樹皮多酚物質分離的效果，故不能使用。在圖2與圖3中我們可以觀察到二者峰型較為相似，流速為10mL／min的波型較好但考慮到流速的增加導致試劑的大量使用，使實驗成本增加，故由上述原因選定流速8mL／min為最佳流速。

2.2 進樣量對出峰面積的影響

以下試驗均為紫外線波長為308nm，流速為8mL／min，濃度梯度為0～10min，0A／100B；10～40min，20A／80B；40～50min，60A／40B；50～60min，65A／35B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B。

（1）選取進樣量為一針0.25mL

圖4 色譜圖

（2）選取進樣量為2針0.50mL

圖5 色譜圖

（3）選取進樣量為3針0.75mL

圖6 色譜圖

（4）選取進樣量為4針1.00mL

圖7 色譜圖

由上述圖4～7發現，進樣量為一針，兩針時的圖形較好析出的物質較純，而進樣量增加后峰型不如前者，進樣一針和進樣兩針相比較一針的較好，且用的樣品較少可以起到節約樣品用量的作用，故選取進樣量一針（0.25mL）為最佳進樣量。

2.3 紫外線波長對出峰面積的影響

以下試驗均為流速為8mL／min，進樣量為1針（0.25mL），濃度梯度為0～10min，0A／100B；10～40min，20A／80B；40～50min，60A／40B；50～60min，65A／35B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B。

（1）紫外線波長為280nm

圖8 色譜圖

（2）紫外線波長為290nm

圖9 色譜圖

（3）紫外線波長為300nm

圖10 色譜圖

（4）紫外線波長為308nm

圖11 色譜圖

（5）紫外線波長為310nm

圖12 色譜圖

（6）紫外線波長為320nm

圖13 色譜圖

（7）紫外線波長為330nm

圖14 色譜圖

（8）紫外線波長為340nm

圖15 色譜圖

由以上圖8～15可分析到紫外線波長才280nm時，最高峰出叉，證明該峰中不僅只含有一種物質，可能還含有兩種以及兩種以上物質，故此波長不予采用。紫外線波長在290nm、300nm、310nm、320nm時均有雜質峰的出現并且出峰時間長試劑用量大，故不予使用。紫外線波長為330nm、340nm時峰型較寬含有過多較大的雜質峰，析出樣品量不夠理想故不予使用，綜上所述，選取波長為308nm為最佳波長。

2.4 濃度洗脫對出峰面積的影響

以下試驗均在流速為8mL／min，進樣量為1針（0.25mL），在紫外線波長為308nm時完成。

（1）濃度洗脫為0～10min，0A／100B；10～40min，20A／80B；40～50min，60A／40B；50～60min，65A／35B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B。

圖16 色譜圖

（2）濃度洗脫為0～10min，0A／100B；10～20min，20A／80B；20～30min，40A／60B；30～40min，60A／40B；40～50min，80A／20B；50～60min，100A／0B；60～90min，100A／0B。

圖17 色譜圖

（3）洗脫濃度為0～10min，0A／100B；10～40min，10A／90B；40～50min，50A／50B；50～60min，70A／30B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B。

圖18 色譜圖

（4）洗脫濃度為0～10min，0A／100B；10～40min，10A／90B；40～50min，60A／40B；50～60min，70A／30B；60～65min，90A／10B；65～100min，100A／0B。

圖19 色譜圖

（5）濃度洗脫為0～10min，0A／100B；10～40min，20A／80B；40～50min，50A／50B；50～60min，70A／30B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B。

圖20 色譜圖

由上述圖16～20可分析可知圖18、圖20出峰時間較長，試劑使用較多故不予使用。圖17、圖19有過多雜質峰，且雜質峰的波動較大對析出物質的純度影響較深，故不予使用。因此可得出濃度洗脫為0～10min，0A／100B；10～40min，20A／80B；40～50min，60A／40B；50～60min，65A／35B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B為最佳濃度洗脫。0～10min，0A／100B。

3 結論

通過單因素試驗得出利用半制備液相法對紅松樹皮多酚物質分離的最佳工藝條件為：流速為8mL／min，進樣量為一針（0.25mL），紫外線波長為308nm，濃度洗脫為0～10min，0A／100B；10～40min，20A／80B；40～50min，60A／40B；50～60min，65A／35B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B。

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