異長春花堿脂質體的制備及其在小鼠體內的組織分布Δ

李學濤，趙琳，程嵐（遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧大連116600）

異長春花堿（Vinorelbine，VRB）是從長春花Catharathus roseus（L）G.Don中提取的一種半合成的長春花生物堿。現代藥理研究表明，VRB通過作用于腫瘤細胞微管蛋白而干擾腫瘤細胞代謝，臨床主要用于治療急性淋巴細胞白血病、何杰金病及非何杰金淋巴瘤，也用于乳腺癌、支氣管肺癌、軟組織肉瘤及神經母細胞瘤等[1]。但由于VRB原料藥極難溶于水，而且VRB酒石酸鹽注射液在臨床應用時具有明顯的毒副作用，因此為了提高VRB的水溶性及靶向性，筆者將VRB用脂質體為載體進行包裹。本研究在此基礎上采用高效液相色譜法測定了VRB脂質體在小鼠體內的分布，并與普通VRB注射液進行比較。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-1100液相色譜儀，包括G21771AA-UV檢測器、色譜工作站（美國安捷倫科技公司）；Mastersizer2000粒徑分析儀（英國Malvern Instruments公司）；JEM-2000EX透射電子顯微鏡（日本電子公司）；DY89-1型電動玻璃勻漿機（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試藥

VRB對照品（美國Sigma公司，批號：FOC242，純度：≥99.0%）；VRB原料藥（海南國棟藥業有限公司，批號：20080512，純度：98.0%）；VRB脂質體（遼寧中醫藥大學自制，批號：091101，規格：0.92 mg·mL－1，包封率：87.5%）；VRB酒石酸鹽注射液（簡稱：VRB注射液，法國皮爾法伯制藥公司，批號：090802，規格：10 mg·mL－1）；鹽酸小檗堿對照品（內標，中國食品藥品檢定研究院，批號：110713-200910，純度：99%）；注射用大豆卵磷脂（上海太偉磷脂有限公司，批號：20080126）；膽固醇（上海惠興生化試劑有限公司，批號：20080113）；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.3 動物

Lewis肺癌C57BL/6J荷瘤小鼠，♀♂各半，5～7周齡，體重（20±2）g，購于大連醫科大學實驗動物中心，合格證號：SCXK（遼）2008-0002。

2 方法與結果

2.1 VRB脂質體的制備

取VRB原料藥10 mg、注射用大豆卵磷脂80 mg、膽固醇39 mg溶于10 mL氯仿中，39.5℃下減壓旋轉蒸發60 min除去氯仿，保持水浴溫度39.5℃，將形成的均勻白色薄膜加入10 mL pH7.6磷酸鹽緩沖液中，水化30 min，超聲20 min（50 kHz），經0.45 μm微孔濾膜濾過，即得[2]。

2.2 VRB脂質體的粒徑分布與形態觀察

精密移取VRB脂質體0.5 mL，以5%葡萄糖注射液稀釋至20 mL，用Mastersizer2000粒徑分析儀進行測定，以微粒的個數作為基準，測定其粒徑并繪制粒徑分布圖。結果，所測得微粒的平均粒徑為158.3 nm，粒徑分布圖見圖1。采用磷鎢酸負染色法觀察VRB脂質體微粒的微觀形態，移取VRB脂質體0.1 mL，加蒸餾水稀釋至5.0 mL，混勻。取稀釋后的脂質體溶液1滴，置于特制銅網上，靜置5 min，滴加1%磷鎢酸負染色，用濾紙吸去多余染色液，在電鏡下觀察VRB脂質體微粒的形態和大小，并照相，電鏡觀察照片見圖2。

圖1 VRB脂質體粒徑分布圖Fig 1 Particle size distribution of VRB liposomes

圖2 VRB脂質體透射電鏡圖（×20 000）Fig 2 TEMof VRB liposome（×20 000）

2.3 VRB在體內分析方法的建立

2.3.1 色譜條件。色譜柱：C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-0.06 mol·L－1磷酸二氫鉀（用鹽酸調pH為3.0）＝35∶65，流速：1.0 mL·min－1；檢測波長：215 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20μL；理論板數按VRB色譜峰計算，應不低于3 000[3]。

2.3.2 血漿樣品預處理。取小鼠血漿0.5 mL，置于具塞刻度離心管中，加入濃氨水2滴，精密加入內標鹽酸小檗堿對照品溶液（0.95 mg·mL－1）30 μL，旋渦振蕩10 min，再加入乙醚萃取2次，每次5.0 mL，合并乙醚液，于35℃水浴上N2流下揮干乙醚，殘渣加入流動相300 μL超聲溶解，4 000 r·min－1離心10 min，精密吸取上清液，即得。

2.3.3 組織樣品預處理。小鼠脫頸椎處死后，取小鼠臟器吸干、剔去結締組織，分別準確稱取心、肝、脾、肺、腎、肌肉、腦組織、腫瘤樣品約0.1 g（不足者取全部），用高速勻漿器勻漿，用5.0 mL生理鹽水分3次沖洗勻漿器，將組織勻漿完全轉移至具塞刻度離心管中，按照“2.3.2”項下“加入濃氨水2滴，……精密吸取上清液”操作，即得。

2.3.4 方法專屬性考察。取小鼠空白肝臟組織、VRB對照品和加入VRB對照品的肝臟組織，按“2.3.3”項下方法處理后進樣測定。結果，組織內源性物質與VRB在“2.3.1”色譜條件下分離良好，內源性雜質無干擾，VRB的保留時間約為16.65 min，色譜見圖3。

2.3.5 標準曲線的繪制。分別取小鼠空白組織勻漿1.0 mL或空白血漿0.5 mL于干燥試管中，分別加入不同體積的VRB對照品溶液（1.01 mg·mL－1）于試管中，制備成濃度分別為0.2、0.5、1.0、5.0、10.1、25.3、50.5 μg·g－1或μg·mL－1的不同組織或血漿標準溶液，再按“2.3.2”項下“加入濃氨水2滴，……精密吸取上清液”方法進行操作制成樣品，照“2.3.1”項下色譜進樣測定。以鹽酸小檗堿為內標，計算VRB峰面積和內標峰面積的比值K（AV/AT），以K值與VRB的組織或血漿濃度（c）進行線性回歸，得不同組織或血漿的藥物標準曲線方程，結果見表1。

圖3 高效液相色譜圖A.對照品；B.空白組織；C.給藥后肝臟組織；1.VRB；2.鹽酸小檗堿Fig 3 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.blank tissue；C.liver tissue after medication；1.VRB；2.berberine hydrochloride

表1 各組織及血漿中VRB的線性方程Tab 1 Regression equation of VRB in different tissues and plasma

由表1結果表明，VRB在小鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦、肌肉、腫瘤等組織和血漿中的藥物濃度在相應范圍內與K值呈良好線性關系。

2.3.6 精密度試驗。分別取“2.3.5”項下不同樣品，按“2.3.2”和“2.3.3”項下方法處理后，進樣測定，同日內測定5次，及每天測定1次、連續測定5 d，計算日內和日間精密度。結果，小鼠不同組織和血漿樣品的日內RSD＜4.0%，日間RSD＜5.0%，滿足生物樣品的方法學要求。

2.3.7 穩定性試驗。分別取“2.3.5”項下不同樣品，按“2.3.2”和“2.3.3”項下方法處理后，于0、2、4、6、8 h進樣測定，結果RSD＜5.0%，表明樣品穩定性良好。

2.3.8 提取回收率試驗。分別取小鼠空白組織勻漿1.0 mL或空白血漿0.5 mL置于2 mL離心管中，加入VRB對照品溶液并使VRB的組織或血漿濃度為10、5、0.5 μg·g－1或μg·mL－1，按“2.3.2”項下“加入濃氨水2滴，……精密吸取上清液”操作后，進樣測定，記錄峰面積A1；精密量取VRB對照品溶液（1.01 mg·mL－1），加流動相稀釋并制備相應濃度進樣測定，記錄峰面積A2。以A1/A2×100%計算回收率，結果見表2。

結果表明，各種組織或血漿的3種濃度樣品的平均提取回收率均＞85.00%，RSD均＜5.0%，滿足生物樣品的方法學要求。

表2 不同濃度VRB脂質體在體外模型小鼠各組織及血漿中的提取回收率試驗結果Tab 2 Extraction recoveries of VRB liposomes in different tissues and plasma of model mice in vitro

2.4 藥物在小鼠體內組織分布實驗

取Lewis肺癌C57BL/6J荷瘤小鼠，♀♂各半，隨機分為對照組（VRB注射液）和脂質體組（VRB脂質體），每組24只，尾靜脈注射相應藥物10 mg·kg－1（根據VRB脂質體的安全性試驗結果[4]制訂給藥劑量）。各組小鼠分別于給藥后0.5、2、12 h摘眼球取血，然后處死，立即取心、肝、脾、肺、腎、肌肉、大腦、腫瘤，用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干表面水分，準確稱取0.1 g，按“2.3.2”和“2.3.3”項下方法處理后測定，檢測不同時間組織和血漿中VRB的藥物濃度。結果見表3（“-”表示未檢出）。

表3 2制劑在模型小鼠體內不同時間的藥物組織及血漿分布（n＝8）Tab 3 Distribution of VRB preparations in different tissues and plasma of model mice at different time points（n＝8）

由表3可知，與同一時間VRB注射液比較，VRB脂質體在肝、脾、腫瘤中的分布均明顯增強（P＜0.05或P＜0.01），其中靜脈注射VRB脂質體0.5、2.0、12.0 h后藥物主要分布在肝、脾中，并且不同時間點處理樣品，藥物在各組織中的分布趨勢基本一致。該結果可能是由于脂質體微粒激發了機體的免疫系統，單核吞噬細胞系統（MPS）吞噬脂質體微粒，從而使大部分VRB濃集于肝、脾部位。

2.5 靶向性評價

為了更好的闡述VRB脂質體的靶向性，筆者采用靶向性評價參數（cE）來說明。cE＝cP（m）/cP（s），式中，cP為藥物的濃度，m和s分別表示脂質體和溶液，cE說明該脂質體改變藥物分布的效果，cE值越大說明VRB脂質體改變巨噬細胞系統（VEB）分布的效果愈明顯[5]。VRB脂質體在模型小鼠體內不同時間的組織靶向性參數比較見表4（“-”表示未檢出）。

表4 VRB脂質體在模型小鼠體內不同時間的組織靶向性參數比較Tab 4 Drug targeting index of VRB liposomes in model mice at different time points

由表4可知，VRB脂質體在不同時間內對小鼠的肝臟、脾臟組織的靶向性評價參數均大于2.0，表明VRB脂質體在體內具有明顯的肝臟、脾臟靶向性，此靶向機制為被動靶向；其中VRB脂質體對腫瘤組織的平均靶向性參數為3.921 4，表明脂質體對小鼠的腫瘤組織有顯著的靶向性；VRB脂質體對肺組織的平均靶向性參數為1.429 0，表明脂質體對小鼠的肺組織有一定靶向性；VRB脂質體在其他組織中靶向性參數均小于1.0，說明脂質體制劑可以減少藥物在相應組織中的濃度，從而降低藥物的毒副作用。

3 討論

目前，國內外對于VRB含量測定的方法報道較少，僅有少數長春屬類生物堿的含量測定。本方法選擇鹽酸小檗堿作為內標物質，一方面兩者均屬于生物堿，具有相近的結構；另一方面長春花屬的其他生物堿的對照品較難獲得，所以本研究選擇鹽酸小檗堿作為內標物質。結果，該方法操作簡便、快捷，精密度和準確度都較好，方法的建立適合于小鼠體內VRB含量的測定。

VRB制成脂質體后，提高了藥物在肝、脾、腫瘤組織中的濃度，降低了藥物在血、心、大腦、腎、肌肉中的濃度，說明脂質體制劑可以通過減少藥物在相應組織中的濃度，從而降低藥物的毒副作用。制成脂質體后，VRB在小鼠體內的分布發生了明顯變化，脂質體組與注射液組在肝、脾、腫瘤組織中分布具有顯著性差異，其中靜脈注射脂質體0.5、2.0、12.0 h后藥物主要分布在肝、脾和腫瘤組織中。脂質體在肝、脾中的富集可能是由于脂質微粒激發了機體的免疫系統，MPS吞噬脂質體微粒，從而使大部分藥物濃集于肝、脾部位；脂質體在腫瘤組織中的富集可能是由于腫瘤細胞所分泌的大量血管生長因子，使腫瘤組織附近形成豐富的血管網，該血管網中的微血管形狀構造不規則、膨脹、管壁缺失、內皮細胞排列疏松，增加了血管壁的滲漏性和通透性，故脂質微粒較易滲入腫瘤部位而達到對腫瘤的靶向定位。

[1]祖元剛，羅 猛.長春花生物堿成分及其藥理作用研究進展[J].天然產物研究與開發，2006，18：325.

[2]李志浩，李 鵬，鄭 芳，等.白術內酯Ⅰ脂質體的制備工藝[J].中國藥師，2010，13（4）：473.

[3]李學濤，程 怡，時 軍.HPLC法測定異長春花堿靜脈注射乳劑中主藥的含量[J].中國藥房，2009，20（34）：2 707.

[4]程 嵐，李學濤，唐 凌.異長春花堿脂質體的制備及安全性評價[J].中國實驗方劑學雜志，2011，20（17）：241.

[5]張陽德，張 洋，潘一峰，等.槲皮素脂質體納米粒在大鼠體內的分布研究[J].中國醫學工程，2007，15（4）：305.