阿帕替尼對大鼠肝微粒體細胞色素P4503A1酶活性的影響研究Δ

梁蔚婷，劉 韜，黃紅兵，廖 海，馮堯，潘 瑩，魏 雪，周 望，周文菁，陳倩超（中山大學附屬腫瘤醫院，華南腫瘤學國家重點實驗室，廣州 510060）

阿帕替尼（Apatinib）是最新研發并已進入Ⅲ期臨床的一類新藥，是選擇性的小分子血管內皮生長因子（VEGF）受體（VEGFR）酪氨酸酶抑制劑，化學名稱為甲磺酸N-[4-（氰基環戊基）苯基]{2-[（4-吡啶甲基）氨基]（3-吡啶）}甲酰胺（C25H27N5O3S）。藥效學研究[1]表明，該藥可通過抑制VEGFR酪氨酸酶活性、阻滯VEGF與受體結合后的信號傳導、抑制腫瘤血管生成從而治療腫瘤，在體內外試驗中均顯示強大的作用。Ⅰ期臨床研究顯示，阿帕替尼單用或與化療藥物合用都可有效地抑制外源性移植腫瘤物的生成，大部分的抗腫瘤藥物都是通過細胞色素P450（CYP）3A4代謝的。考慮到阿帕替尼與其他抗腫瘤藥物可能發生的相互作用，本實驗在前人研究[2，3]的基礎上，在體外孵育體系中運用高效液相色譜-紫外檢測（HPLC-UV）法以睪酮作為大鼠CYP3A1的探針底物，定量檢測CYP3A1的特異性代謝底物6β-羥基睪酮（6β-OHT）的生成速率，觀察阿帕替尼對大鼠肝微粒體CYP3A1酶活性的影響，為研究該藥臨床應用中與其他藥物的相互作用提供依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1100型HPLC系統（美國Agilent公司）；Avanti J-30I型高速離心機（德國Beckman公司）；XW-80A旋渦混合器（上海醫科大學儀器廠）；CQ-200超聲波清洗器（上海潔凈超聲設備廠）；Ultra-turrax T8組勻漿機（德國IKA公司）。

1.2 試藥

阿帕替尼片（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號：09051256，規格：每片0.375 g）；睪酮（加拿大TRC公司，批號：1-YFD-167-1，純度：≥98%，分子量：288.42）；6β-OHT（批號：051M1145V，純度：≥97%，分子量：304.42）、氫化可的松（內標，批號：059K1248，純度：≥98%）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯（NADPH）均購自美國Sigma公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四醋酸（EDTA）均購自瑞士Roche公司；0.9%氯化鈉注射液（浙江濟民制藥股份有限公司，批號：11071461，規格：每袋250 mL）；地塞米松磷酸鈉原料藥（天津天藥藥業股份有限公司，批號：DNa090302，純度：≥97%）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號：0907231116）；甲醇（美國Tedia公司）；乙酸乙酯、磷酸氫二鈉、氯化鈣等其他試劑均為國產分析純。

1.3 動物

SD大鼠25只，♂，SPF級，體重（241±26）g，中山大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SCXK（粵）2009-0011。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil BDS C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-2 mmol·L－1磷酸氫二鈉水溶液（pH 8.25，55∶45，V/V），流速：1.0 mL·min－1；檢測波長：254 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

精密稱取睪酮0.288 g，置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為200 mmol·L－1的睪酮母液，置于4℃、備用。精密稱取6β-OHT 1 mg，置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得濃度為200 mg·L－1的6β-OHT標準溶液，置于－20℃貯存、備用。精密稱取氫化可的松25 mg，置于5 mL量瓶中，用甲醇-水（1∶1）溶解并稀釋到刻度，搖勻，得濃度為5 g·L－1的氫化可的松標準溶液，置于4℃貯存、備用。稱量適量Tris、EDTA和二硫蘇糖醇（DTT），用含20%甘油的雙蒸水溶解制成含0.1 mol·L－1Tris、0.1 mmol·L－1EDTA和0.1 mmol·L－1DTT的溶液，用6 mol·L－1的HCl調pH至7.4，制成0.1 mol·L－1Tris-HCl（pH7.4）緩沖液，用于肝微粒體制備。

2.3 鈣沉淀法制備大鼠肝微粒體

取大鼠禁食12 h，自由飲水，稱重后，斷頭處死，剖腹，取出肝臟，用4℃0.9%氯化鈉注射液沖洗2～3次，直至洗出液為無色或淡黃色，吸干組織并稱重，取5 g左右肝組織，以0.25 mol·L－1蔗糖溶液制成20%（W/V）的組織勻漿，16 000 g離心20 min，取上清液轉移至超速離心管，加入88 mmol·L－1CaCl2（0.1 mL·mL－1），于冰浴中振搖5 min，27 000 g離心15 min，棄去上清液，沉淀用含20%甘油的0.1 mol·L－1Tris-HCl（pH7.4）緩沖液混懸均勻，分裝，于－80℃保存、備用。

2.4 肝微粒體蛋白濃度的檢測

取BCA蛋白濃度測定試劑盒中的蛋白標準品（5 mg·mL－1）10 μL，用10 mmol·L－1磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）溶解并稀釋至0.5 mg·mL－1。將0.5 mg·mL－1的蛋白標準品稀釋液按0、1、4、8、12、16、20 μL加到96孔板中，用PBS稀釋至20 μL（分別相當于濃度為 0、0.025、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg·mL－1的蛋白標準溶液）。另外按BCA試劑A-BCA試劑B（50∶1，V/V）制備BCA工作液，在樣品孔中加入制備好的BCA工作液200 μL，于37℃恒溫箱中靜置1 h，于562 nm波長處測定吸光度。以蛋白濃度（X）與吸光度（Y）繪制標準曲線，得回歸方程為Y＝0.109+1.12X（r＝0.998 9）。結果表明，蛋白濃度在0.05～0.50 mg·mL－1線性范圍內與吸光度呈良好線性關系（具體步驟參見BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書）。

2.5 體外孵育試驗

精密吸取20 mmol·L－1的睪酮溶液5 μL，置于10 mL玻璃離心管中，加入適量制備好的肝微粒體，使藥物反應體系中肝微粒體蛋白終濃度為0.25 mg·mL－1，用PBS補足體系至450 μL，于 37 ℃水浴中預孵育 5 min，加入 50 μL NADPH（10 mmol·L－1）啟動反應，37 ℃水浴10 min，加入3.5 mL冰冷乙酸乙酯終止反應，最后加入10 μL氫化可的松（50 mg·L－1）。

2.6 樣品處理

取“2.5”項下終止反應的樣品，渦旋1 min，室溫放置10 min，3 500 r·min－1離心10 min，吸取上清液轉移至另一離心管中，于真空干燥箱中揮干，用甲醇-水（1∶1）200 μL溶解，渦旋1 min，13 000 r·min－1離心10 min，吸取上清130 μL，進樣20 μL。

2.7 滅活肝微粒體的制備

取大鼠正常肝微粒體，在95～100℃煮沸1 min，得大鼠滅活肝微粒體。

2.8 專屬性考察

分別制備大鼠空白滅活肝微粒體、滅活肝微粒體+睪酮（20 mmol·L－1，5 μL）+氫化可的松（50 mg·L－1，10 μL）+6β-OHT（20 mg·L－1，50 μL）、滅活及正常肝微粒體+睪酮，按“2.5”項下進行孵育后，照“2.6”項下處理，進樣分析。結果表明，6β-OHT、氫化可的松、睪酮與其他雜質組分峰分離良好，保留時間分別約為3.94、5.22、14.26 min，且空白滅活肝微粒體中的內源性物質不干擾測定。色譜見圖1。

圖1 離體高效液相色譜圖A.空白滅活肝微粒體；B.滅活肝微粒體+睪酮+氫化可的松+6β-OHT；C.滅活肝微粒體溫孵睪酮；D.正常肝微粒體溫孵睪酮；1.6β-OHT；2.氫化可的松；3.睪酮Fig 1 HPLC chromatograms in vitroA.blank inactivated liver microsomes；B.inactivated liver microsomes+testosterone+hydrocortisone+6β-OHT standards；C.testosterone incubated with inactivated liver microsomes；D.testosterone incubated with normal liver microsomes；1.6β-OHT；2.hydrocortisone；3.testosterone

2.9 標準曲線的繪制

取10 mL具塞離心管，分別加入5、10、20、40、80、120、160 μg·mL－1的6β-OHT溶液50 μL，加入適量肝微粒體制備成6β-OHT濃度為0.5、1、2、4、8、12、16 μg·mL－1的大鼠滅活肝微粒體溫孵樣品，按“2.6”項下方法處理，進樣測定，以6β-OHT與內標峰面積比（Y）為縱坐標、6β-OHT的濃度（X）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程為Y＝0.306 3X+0.064（r＝0.999 5）。結果表明，6β-OHT檢測濃度的線性范圍為0.5～16 μg·mL－1。

2.10 精密度試驗

按照“2.9”項下方法制備低、中、高（1、4、12 μg·mL－16β-OHT）濃度的大鼠滅活肝微粒體溫孵樣品，各5份，按“2.6”項下方法處理，進樣測定，每日1次，連續3 d，計算日內和日間RSD，結果見表1。

表1 精密度和回收率試驗結果Tab1 Results of precision and recovery tests

2.11 回收率試驗

取“2.10”項下制備的低、中、高濃度的大鼠滅活肝微粒體溫孵樣品，各5份，同法操作，以檢測值/實際濃度值×100%，計算方法回收率。另取低、中、高濃度的大鼠滅活肝微粒體溫孵樣品，各5份，處理后進樣測定，記錄6β-OHT的峰面積A1；再以甲醇-水（1∶1）稀釋上述3種濃度的6β-OHT標準溶液，進樣測定，其峰面積為A2，6β-OHT在肝微粒體中的萃取回收率以公式A1/A2×100%進行計算。結果見表1。

2.12 穩定性考察

取“2.10”項下制備的低、中、高濃度的大鼠滅活肝微粒體溫孵樣品，各5份，于室溫放置0、4、8 h后，按“2.6”項下方法處理，進樣測定。結果，RSD均＜5.42%，表明樣品在8 h內穩定。

2.13 CYP3A1酶活性研究

2.1 3.1 分組與給藥。取25只大鼠隨機分為空白對照組（生理鹽水1 mL·kg－1）、地塞米松組（100 mg·kg－1）和阿帕替尼高、中、低劑量組（100、50、25 mg·kg－1），每組5只，灌胃給予相應藥物，每日1次。除地塞米松組連續給藥3 d外，其余各組連續給藥14 d。所有大鼠在整個實驗期間均自由飲食。

2.1 3.2 給藥劑量的選擇。阿帕替尼臨床應用的推薦劑量是750 mg·d－1[4]，按照人體體表面積及物種給藥劑量換算公式[5]，可計算出大鼠的正常給藥劑量為78.125 mg·kg－1·d－1，在預實驗中觀察到大鼠對150 mg·kg－1·d－1和100 mg·kg－1·d－1的劑量不耐受，因此在設定給藥方案時，參考阿帕替尼臨床試驗（Ⅰ期）報告，大鼠的等效有效劑量為50 mg·kg－1·d－1，以該劑量為中劑量，高低劑量分別遞增和遞減1倍。阿帕替尼的臨床用藥周期為1個療程28 d，因為酶誘導與基因轉錄增加有關，在4～14 d達到最大值[6]，所以本實驗將阿帕替尼的給藥周期設定為14 d。

2.1 3.3 指標檢測。各組大鼠末次給藥后禁食不禁水12 h，按“2.3”項下方法取肝微粒體檢測其中6β-OHT的濃度。

2.1 3.4 數據處理及結果。關于酶動力學參數的測定，最佳孵育時間及蛋白濃度均需在線性范圍內，酶濃度和孵育時間在線性范圍內要求底物被結合量低于20%[6]，因此，在進行睪酮在大鼠肝微粒體中的酶濃度和孵育時間優化時，發現大鼠肝微粒體孵育體系在2.5～20 min內6β-OHT的產量與時間呈線性關系，結合前述要求，選用了10 min為最佳孵育時間。用探針代謝物6β-OHT的生成速率（6β-OHT的摩爾濃度/孵育時間/肝微粒體蛋白濃度）表示CYP3A1酶活性，各組間的比較采用單因素方差分析，用SPSS 13.0統計學軟件處理，結果見表2。

表2 各組6β-OHT的生成速率比較（±s，n＝5）Tab 2 Comparison of the productive velocity of 6β-OHT in each group（±s，n＝5）

表2 各組6β-OHT的生成速率比較（±s，n＝5）Tab 2 Comparison of the productive velocity of 6β-OHT in each group（±s，n＝5）

與空白對照組比較：＊P＜0.01；與地塞米松組比較：#P＜0.01vs.blank control group：＊P＜0.01；vs.dexamethasone group：#P＜0.01

6β-OHT的生成速率/nmol·mg－1protein·min－1 3.41±0.39 23.36±1.76＊4.25±0.48#3.82±0.40#3.48±0.74#組別空白對照組地塞米松組阿帕替尼高劑量組阿帕替尼中劑量組阿帕替尼低劑量組

由表2可見，阿帕替尼高、中、低劑量組酶活性遠低于地塞米松組（P＜0.01），與空白對照組無明顯差別。因此，本實驗結果表明阿帕替尼對大鼠肝微粒體CYP3A1無誘導作用。

3 討論

CYP450是一組含有亞鐵血紅素的酶蛋白，又稱混合功能氧化酶或單加氧酶，是肝臟中主要的藥物代謝Ⅰ相酶，涉及藥物代謝的 CYP450酶系主要為 CYP1、CYP2、CYP3 家族，而CYP3A4是其中重要的藥物代謝酶，參與50%上市藥物的Ⅰ相代謝[7]，其在大鼠中的相應亞型為CYP3A1。地塞米松是CYP3A4酶的經典的誘導劑，對人及大鼠的CYP3A4/1均有較強的誘導作用，在考察受試藥對CYP3A4酶的誘導作用時，可以地塞米松作為陽性誘導對照，把地塞米松溶于生理鹽水對大鼠灌胃給藥，劑量為100 mg·kg－1，每日1次，連續3 d[6]。

根據阿帕替尼同類藥物的相關研究顯示，厄洛替尼、伊馬替尼、吉非替尼、索拉非尼均是CYP3A4的底物[8～10]，而CYP3A4強抑制劑可以抑制厄洛替尼代謝，使其血藥濃度升高[11，12]。伊馬替尼的藥-時曲線下面積（AUC）可被CYP3A4的酶誘導劑或抑制劑影響而降低或升高[9]，索拉非尼和舒尼替尼可抑制CYP3A4酶介導的底物代謝[13]，在體外肝微粒體孵育實驗中，吉非替尼與厄洛替尼可誘導CYP3A4底物咪達唑侖的代謝，但兩者的作用存在差異[14]。由此可推測，阿帕替尼可能會發生由CYP3A4介導的藥物相互作用。

多種抗腫瘤藥物的代謝，如腫瘤化療過程中環磷酰胺、紫杉醇、長春新堿等化療藥物都是CYP3A4/5的底物[15，16]，阿帕替尼與抗腫瘤藥物及其他輔助用藥如中藥復方制劑合用的現象不可避免，大多數抗腫瘤藥物治療窗狹窄，而CYP3A4參與了臨床多種抗腫瘤藥物的代謝，CYP3A4酶活性的改變會引起其相應底物的代謝變化，導致相互作用，引起治療失敗或者嚴重不良反應；同時，中藥復方制劑含多種化學成分，與該類藥物合用時，發生藥物相互作用的可能性就會增加[17，18]。

目前為止，尚無阿帕替尼對肝微粒體CYP450及其主要藥物代謝亞型的影響的文獻報道，本研究希望探索阿帕替尼在臨床應用中，與抗腫瘤藥物及其他輔助用藥廣泛聯合應用時，對于重要藥物代謝酶CYP3A4活性的影響。本實驗結果表明，阿帕替尼對大鼠肝微粒體CYP3A1的活性無誘導作用，但由于大鼠和人的CYP酶存在種屬差異，阿帕替尼與抗腫瘤藥物及其他輔助用藥合用的潛在不良藥物相互作用還需要進一步研究。

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