鹿角杜鵑嫩葉離體培養和高效植株再生1)

楊麗娟 顧地周 王秋爽 禚玲玲 潘 雨 付 航 張學士

(通化師范學院，通化，134002)

鹿角杜鵑(Rhododendron latoucheae Franch.)又稱巖杜鵑，是杜鵑花科杜鵑花屬的常綠灌木或小喬木。主要分布浙江、江西、福建、湖北、湖南、廣東、廣西、四川和貴州等地的山坡灌叢或雜木林中。鹿角杜鵑是優良的、有待研究開發的園林綠化樹種，可引種馴化成為露地栽培的園藝觀賞植物，是杜鵑育種的重要種質資源。利用種子和嫁接等方法繁殖存在種子萌發率和繁殖系數極低等問題，使其開發及利用受到極大限制。向光鋒等［1］利用1年生完全木質化的鹿角杜鵑枝條進行了扦插研究，平均成活率達85%，扦插生根速度較慢。江蘇省農科院劉曉青等人以鹿角杜鵑嫩莖尖或莖段為材料，通過基部愈傷組織再分化形成叢生芽的方式對鹿角杜鵑進行離體培養，生根率為85.4%，但并未建立高效的快繁體系。本研究利用植物組織培養方法，以鹿角杜鵑嫩葉為材料，通過誘導嫩葉產生愈傷組織、愈傷組織再分化形成叢生芽方式對鹿角杜鵑進行快繁，為避免愈傷組織叢生芽苗遺傳多樣性在繼代過程中的可能丟失，又在生根培養基的基礎上探索節增殖的高效植株再生體系，以開創一步成苗技術，提高增殖系數。目前，與其同屬的其他種植物離體培養和鹿角杜鵑其他方面研究已有報道［2-6］，但利用鹿角杜鵑葉片離體培養和節增殖建立高效植株再生體系研究在國內外尚未見報道。

1 材料與方法

1.1 外植體材料的來源和處理

鹿角杜鵑枝條采自江西省井岡山，將枝條莖尖剪除后在實驗室內水培促其腋芽萌發生長。待腋芽萌發放出鮮嫩葉片后將嫩葉剪下，用70%酒精涮洗5 s，再用3%次氯酸鈉溶液浸泡10 min，無菌水沖洗6次，無菌濾紙吸干表面水分后備用。

1.2 鹿角杜鵑嫩葉愈傷組織的誘導

以DR為基本培養基［7］，附加不同質量濃度的玉米素ZT(由預試驗確定為2.10～2.80 mg·L-1)和吲哚乙酸IAA(由預試驗確定為0.30～0.70 mg·L-1)，內含蔗糖 30 g·L-1，瓊脂粉 7.0 g·L-1，調節pH值為5.7，將1.1中處理的葉片切割成0.50 cm左右的葉碟接種到培養基中，在溫度(26±2)℃、光照強度800 lx、光照周期12 h·d-1條件下培養。為了提高鹿角杜鵑嫩葉愈傷組織誘導的速度和誘導率，應用均勻設計法設計實驗，選用U10(102)均勻表，每個處理接種10個葉碟數，重復3次取誘導率的平均值，篩選誘導鹿角杜鵑嫩葉愈傷組織的玉米素和吲哚乙酸最適宜的質量濃度配比。嫩葉碟培養40 d統計誘導率。

1.3 鹿角杜鵑嫩葉愈傷組織的芽苗再分化

以DR為培養基，添加不同質量濃度的玉米素ZT(由預試驗確定為2.60～3.30 mg·L-1)、吲哚乙酸 IAA(由預試驗確定為0.05～0.20 mg·L-1)和激動素 KT(由預試驗確定為 1.30～1.80 mg·L-1)，加入蔗糖30 g·L-1，瓊脂7.0 g·L-1，調節 pH 值為5.7，將嫩葉愈傷組織切割成小塊，在溫度(28±2)℃、光照強度1 200 lx、光照周期10 h·d-1條件下培養。選用U12(123)均勻表，每個處理接種愈傷組織塊數為10，重復3次，篩選最適合鹿角杜鵑嫩葉愈傷組織芽苗分化的玉米素、吲哚乙酸和激動素質量濃度配比。愈傷組織培養45 d統計分化率。

1.4 鹿角杜鵑芽苗生根、植株高效再生體系和煉苗

以1/4DR為培養基，并附加不同質量濃度的激動素 KT(由預試驗確定為0.20～0.75 mg·L-1)、吲哚乙酸IAA(由預試驗確定為0.10～0.20 mg·L-1)和吲哚丁酸IBA(由預試驗確定為0.05～0.15 mg·L-1)，添加蔗糖 10 g·L-1，瓊脂 6.8 g·L-1，調節 pH為5.6，待愈傷組織再分化的芽苗長至2.00 cm時，將切下芽苗接種到培養基中，在溫度(23±2)℃、光照強度800 lx、光照周期8 h·d-1條件下培養。為了提高鹿角杜鵑的生根率，選用U12(123)均勻表，每個處理接種芽苗數為10，重復3次取平均值，篩選最適合鹿角杜鵑再生芽苗生根的激動素、吲哚乙酸和吲哚丁酸的質量濃度配比。芽苗培養40 d統計生根率。

采取節增殖方式對鹿角杜鵑進行高效快繁，待生根的苗伸長至3.00 cm以上時，在超凈工作臺上打開培養瓶，將生根的苗留1或2葉剪下苗干，并切割成1或2葉1段轉接到附加赤霉素GA32.30 mg·L-1的生根培養基中，進行腋芽萌發伸長同時生根培養，統計并計算每瓶中每段莖節的增殖倍數和周期。

芽苗生根后，從培養瓶中取出再生植株，在含有10 mg·L-1高錳酸鉀溶液中洗去根部殘留的瓊脂，然后植入經200倍液的殺毒礬消毒過的V(草炭土)∶V(河砂)∶V(腐爛松針)=3∶1∶2的混合基質中，用透光好的塑料薄膜覆蓋以保濕保溫，相對濕度保持在80%，溫度控制在(20±2)℃，每天自然光照12 h，每天中午適當通風換氣，每天早晚噴灑清水各1次。

1.5 數據處理與分析

通過均勻設計法進行試驗設計，數據經分析處理后摸索出各因素對愈傷組織誘導率、芽苗分化率和生根率的影響，再經過進一步驗證實驗篩選愈傷組織誘導、芽苗再分化和生根的主要因素質量濃度。均勻設計軟件采用Uniform Design 3.0V。

2 結果與分析

2.1 培養基中影響鹿角杜鵑嫩葉愈傷組織誘導的主要因素篩選

表1中試驗所得數據經分析處理后可知，檢驗值 Ft＞臨界值 F(0.05，2，7)，說明回歸方程顯著(表2)。通過回歸方程可知，玉米素和吲哚乙酸的最優質量濃度分別為2.80和0.70 mg·L-1，以此組合計算愈傷組織誘導率的最優解為97.5%，此解為回歸方程的解析解，需按公式Y=y±uα·s(其中uα為正態分布的雙側分位數，s為剩余標準差)計算出優化值估計區間為93.86%～101.14%。由回歸方程可知，玉米素和吲哚乙酸均與愈傷組織誘導率呈正相關，以免玉米素在2.10 mg·L-1和吲哚乙酸在0.70 mg·L-1以上有更高的愈傷組織誘導率，因此，又以玉米素質量濃度為 2.10～2.50 mg·L-1，以及吲哚乙酸質量濃度為0.70～1.00 mg·L-1做了9個處理補充試驗(重復3次取平均值)，結果表明：玉米素質量濃度為2.60 mg·L-1和吲哚乙酸為0.75 mg·L-1時愈傷組織誘導率最高且愈傷組織質量和形態最好。按1.2中的的方法，將葉片切割成0.50 cm左右的葉碟接種到附加玉米素2.60 mg·L-1和吲哚乙酸0.75 mg·L-1的DR培養基上進行驗證試驗(重復3次取平均值)。葉碟培養6 d開始增厚;繼續培養至20 d，葉碟逐漸增厚變形，在葉塊表面出現綠色的愈傷組織;培養至40 d，葉碟完全轉變為黃綠色的愈傷組織(圖1a)，誘導率達99.2%，比表1中10個處理的誘導率均高，且在估計區間內。

2.2 培養基中影響鹿角杜鵑愈傷組織芽苗再分化的主要因素篩選

表3中試驗所得數據經分析處理后可知，檢驗值 Ft＞臨界值 F(0.05，3，8)，回歸方程顯著(表2)。由回歸方程和回歸分析結果可知，玉米素、吲哚乙酸和激動素的最優質量濃度分別是3.30、0.05 和 1.80 mg·L-1，那么，最優解析解為97.0%，優化值估計區間為93.59%～100.41%。由表2可知，玉米素和激動素均與分化率呈正相關，吲哚乙酸與分化率呈負相關。避免玉米素質量濃度在3.30 mg·L-1和激動素在1.80 mg·L-1以上及吲哚乙酸在0.05 mg·L-1以下有較高的分化率，因此，以玉米素質量濃度為3.30～3.50 mg·L-1，吲哚乙酸質量濃度為 0～0.05 mg·L-1，以及 KT 質量濃度為 1.80～2.00 mg·L-1做了12個處理的補充試驗，重復3次取平均值，發現玉米素質量濃度為3.35 mg·L-1，吲哚乙酸質量濃度為 0.05 mg·L-1，激動素質量濃度為 1.90 mg·L-1時愈傷組織分化率最高且芽苗形態最佳。待嫩葉碟完全脫分化形成愈傷組織后，將愈傷組織切割成小塊將其接種到添加玉米素3.35 mg·L-1、吲哚乙酸0.05 mg·L-1和激動素 1.90 mg·L-1的 DR 培養基上進行驗證試驗，培養12 d發現愈傷組織表面產生大量顆粒狀小凸起，繼續培養至25 d，顆粒狀小凸起逐漸轉變為錐狀，培養至35 d，錐狀體生長并伸長為不定芽(圖1b)，培養至45 d，愈傷組織分化出大量的不定芽，不定芽高度可達1.50 cm以上(圖1c)，平均分化率可達99.9%，在估計區間內，且比表2中12個水平的分化率均高。可見，鹿角杜鵑嫩葉愈傷組織芽苗再分化的最佳培養基為：DR+ZT3.35 mg·L-1+IAA0.05 mg·L-1+KT1.90 mg·L-1。

表1 影響鹿角杜鵑愈傷組織誘導主要因素的U10(102)試驗

2.3 培養基中影響鹿角杜鵑再生芽苗生根的主要因素篩選

由表4中試驗所得數據和回歸分析結果(表2)可知，檢驗值 Ft＞臨界值 F(0.05，2，9)，表明回歸方程有意義。同理，根據回歸方程獲知，激動素和吲哚丁酸的最優質量濃度分別為0.20和0.05 mg·L-1，計算生根率的最優解析解為93.6%，同2.1中公式計算得優化值估計區間為86.53%～101.67%。通過回歸分析可知，激動素和吲哚丁酸均與生根率呈負相關。猜測激動素質量濃度在0.20 mg·L-1和吲哚丁酸在0.05 mg·L-1以下有較高的生根率，又以激動素質量濃度為0～0.20 mg·L-1，以及吲哚丁酸質量濃度為0～0.05 mg·L-1做了6個水平的補充試驗，重復3次。結果表明，激動素質量濃度為0.10 mg·L-1和吲哚丁酸質量濃度為0.04 mg·L-1時芽苗生根率最高。因此，待2.2中誘導的再生芽苗長至2.00 cm左右時，在無菌條件下打開培養瓶將生長健壯的芽苗從芽團上切下，轉接到附加激動素0.10 mg·L-1和吲哚丁酸0.04 mg·L-1的1/4DR培養基中做驗證實驗，再生芽苗培養7 d，在芽苗切口處有微小錐狀顆粒出現，培養15 d后錐狀顆粒逐漸轉變為白色的根錐，培養至30 d根錐伸長為不定根，培養至40 d可形成5條以上含有側根的不定根(圖1d)，生根率達98.0%以上，在估計區間范圍內，且比表4所列12個水平的生根率均高。可見，鹿角杜鵑再生芽苗生根的最佳培養基為：1/4DR+KT0.10 mg·L-1+IBA0.04 mg·L-1。

按照1.4中的方法，對生根培養基進行改良，即為 1/4DR+KT0.10 mg·L-1+IBA0.04 mg·L-1+GA32.30 mg·L-1。再生植株含有葉腋的莖節在培養基上培養40 d后，腋芽逐漸萌發伸長生長，同時在莖段靠近切口的干部可發出3～5條不定根，苗高可達4.5 cm(圖1e)。快繁的結果表明，經過38 d的培養后，每節段平均增殖7倍以上，植株再生率為96.5%。

表2 鹿角杜鵑離體培養和高效植株再生各階段的回歸分析結果

根據1.4中的方法，待芽苗生根后并長至3.00～4.00 cm以上時進行移栽煉苗，鹿角杜鵑再生植株經過煉苗后，12 d可揭去薄膜，成活率達98.5%以上(圖1f)。

3 結論與討論

本研究結果表明，培養基DR+ZT2.60 mg·L-1+IAA0.75 mg·L-1對鹿角杜鵑嫩葉愈傷組織誘導的效果最好，當玉米素和吲哚乙酸質量濃度分別超過2.60 mg·L-1和0.75 mg·L-1時誘導的愈傷組織顏色變白且質地松軟而失去分化能力，質量濃度分別低于2.10 mg·L-1和0.30 mg·L-1時愈傷組織誘導率均低于58.0%;培養基 DR+ZT3.35 mg·L-1+IAA 0.05 mg·L-1+KT 1.90 mg·L-1對鹿角杜鵑嫩葉愈傷組織再分化的效果最佳，玉米素質量濃度低于2.60 mg/L和高于3.35 mg·L-1時愈傷組織芽苗分化率均下降，均在45.0%以下，說明低質量濃度的玉米素滿足不了鹿角杜鵑愈傷組織芽苗的分化，而過高質量濃度的玉米素對愈傷組織芽苗的分化起抑制作用。適宜質量濃度的吲哚乙酸有利于芽苗的生長。在培養基中附加KT1.90 mg·L-1，分化的芽苗比未附加的粗壯、長勢好且分化速度快［8］;在添加激動素0.10 mg·L-1和吲哚丁酸0.04 mg·L-1的1/4DR培養基中對鹿角杜鵑愈傷組織再分化芽苗進行生根培養的結果表明，生根速度快，平均生根率高達98.0%以上，吲哚乙酸對鹿角杜鵑的生根影響不顯著。當吲哚丁酸低于0.04 mg·L-1時芽苗生根率僅為57.0%，高于0.15 mg/L時，芽苗基部膨脹并產生愈傷組織，繼續培養根從愈傷組織上產生，含有這樣根的苗在煉苗移栽時根隨愈傷組織從苗基部脫落，成活率極低，原因可能是根中和苗莖的疏導組織連接錯位導致的，Danielle等［9］的研究也發現了這一缺點。高效快繁采取再生植株莖節增殖的方式，在生根培養基中附加2.30 mg·L-1的赤霉素有利于腋芽快速萌發和生長［10］，從而縮短了莖節的增殖周期，提高了增殖倍數，該方法與王雯雯等［11］開展的大字杜鵑快繁研究有共同點。該方法成本低，簡捷而可操作性強，可用于工廠化育苗。

表3 影響鹿角杜鵑愈傷組織再生芽苗分化主要因素的U12(123)試驗

鹿角杜鵑嫩葉愈傷組織誘導過程中，對玉米素和吲哚乙酸進行顯著性檢驗可知，玉米素和吲哚乙酸均對愈傷組織誘導率影響顯著。由回歸分析結果計算出玉米素和吲哚乙酸對回歸的貢獻率分別為74.3%和31.0%，說明玉米素對愈傷組織的誘導率的貢獻遠遠大于吲哚乙酸，可見玉米素對鹿角杜鵑嫩葉愈傷組織誘導的貢獻大于吲哚乙酸，說明玉米素在鹿角杜鵑嫩葉愈傷組織誘導中起主導地位，鹿角杜鵑嫩葉愈傷組織是嫩葉細胞脫分化后經增殖形成的細胞團，細胞的增殖主要依賴于玉米素的細胞分裂和分化作用，吲哚乙酸在嫩葉愈傷組織誘導中促進嫩葉細胞的脫分化;嫩葉愈傷組織再分化過程中，通過顯著性檢驗可知，玉米素、吲哚乙酸和激動素對愈傷組織分化率影響均顯著，貢獻率分別是19.7%、9.76% 和 10.2%，可見玉米素對愈傷組織芽苗再分化率的貢獻大于吲哚乙酸和激動素，說明玉米素在鹿角杜鵑嫩葉愈傷組織芽苗的再分化中起主要作用，這一點體現了玉米素對植物細胞功能分化的作用，吲哚乙酸和赤霉素分別促進了再生芽苗的生長和伸長;在鹿角杜鵑再生芽苗生根過程中，同理，經顯著性檢驗可知，激動素和吲哚丁酸兩個因素對生根率影響顯著，而吲哚乙酸對生根率影響不顯著，激動素和吲哚丁酸對生根的貢獻率分別為86.3%和13.7%，表明激動素對再生芽苗的生根貢獻遠遠大于吲哚丁酸，這說明鹿角杜鵑試管苗的生根對激素具有選擇性，生根所需的生長素主要依賴于吲哚丁酸，輔以適當濃度的激動素有利于植物細胞趨于根器官功能的分化，并且在鹿角杜鵑生根中激動素其決定性作用。本試驗結果同時說明了每種植物對不同植物生長調節物質都具有不同程度的選擇性［12］，這可能是由植物自身的基因型控制的，而基因型不同又決定了細胞分裂、分化和器官重建所依賴的植物生長調節物質種類及其質量濃度高低有所不同。

表4 影響鹿角杜鵑生根主要因素的U12(123)試驗

目前，國外有許多野生杜鵑優良品種已通過人工繁殖并馴化為園藝栽培種。我國野生杜鵑品種眾多，但人工繁殖并開發利用極少。鹿角杜鵑是我國珍稀植物資源和園藝觀賞植物，至今未見推廣應用。本結果建立了鹿角杜鵑嫩葉離體培養和高效植株再生體系。為鹿角杜鵑和其它野生杜鵑優良品種的開發利用和工廠化育苗奠定基礎和提供方法。

圖1 鹿角杜鵑嫩葉離體培養和高效植株再生各階段的形態

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