脊柱結核植入內固定安全性的體外實驗研究

矢慶明，殷 明，顧玉榮，吳 凱，吳 慶

（南昌大學第二附屬醫院骨一科，南昌 330006）

脊柱結核又稱為Pott’s病，Percival Pott在1877年首次報道由結核菌引起脊柱后凸畸形伴有截癱的脊柱疾患。近年來，隨著HIV感染者數量增加結核發病率明顯增高[1]。大多數脊柱結核呈隱匿性起病，從癥狀出現到臨床確診平均需11.2個月[2]，患者往往在神經壓迫癥狀出現后數周、數月因癥狀加重甚至出現癱瘓才就醫，通過前路病灶清除可以對病灶處的膿液、死骨等壞死組織及結核桿菌作直接最有效的清除，術中為重建脊柱穩定性及矯正術前畸形往往需要植入內固定材料及自體骨，盡管術中通過沖洗等方式對結核桿菌進行了有效地清除，但結核桿菌仍不可避免的在病灶內有殘留。以往研究早已證明，引起生物材料相關感染的初始動因就是細菌對生物材料的黏附[3]。生物材料的細菌黏附是指細菌與生物材料表面發生的特異性結合，對機體及材料的黏附幾乎是所有細菌所具有的普遍性能[4]。細菌表面的菌毛、肽聚糖、有黏附功能的莢膜、細胞外黏質（Extracellar Slime Substance,ESS）、脂壁酸等稱為黏附素（A dhesin）,是黏附過程中的配體，生物材料表面與黏附素結合的位點叫受體，黏附就是受體與配體的特異性結合[4]。細菌對生物材料黏附后形成的包繞材料表面的生物膜可以避免細菌被機體吞噬細胞及抗生素殺滅，而且會不斷向組織、血液中釋放細菌形成慢性感染源，造成術后感染遷延不愈或復發。所以通過觀察結核桿菌對材料的黏附情況能對術中植入內固定材料的安全性評估提供實驗依據。筆者通過在體外模擬脊柱結核患者病灶清除植骨內固定術后體內環境，將3種不同材料的內固定分別與結核桿菌及表皮葡萄球菌共同培養，并通過掃描電鏡觀察，比較不同細菌對不同材料的黏附情況，并探討脊柱結核病灶清除后植入內固定的安全性問題，為臨床選擇合理術式及安全的內植物材料提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

不銹鋼 316L、鈦合金 Ti6AL4V、純鈦 CPTi，（山東威高骨科材料有限公司提供）。將材料切割加工成直徑6.0 mm、厚度2.0 mm的圓片，其表面粗糙度和臨床產品保持一致。每種材料制備48片，經蒸餾水洗滌，高壓蒸汽滅菌后保持無菌備用。

1.2 實驗菌株

結核分枝桿菌 （mycobacterium tuberculosis，MTB）標準株H37Rv，江西省胸科醫院檢驗科提供；表皮葡萄球菌（staphylococcus epidermidis，SE）標準株NCCPBP26115，南昌大學基礎醫學院微生物學教研室提供。

1.3 實驗菌液的制備

將結核桿菌接種于Middlebrook7H12液體培養基（購自美國Bacton-Dickinsn公司）中37℃恒溫培養4周，表皮葡萄球菌接種于常規肉湯培養基中培養1 d，分別離心收集細菌，生理鹽水洗滌，再將結核桿菌注入Middlebrook 7H12液體培養基中制成濃度為108 CFU·m L－1懸液備用，將表皮葡萄球菌注入常規肉湯培養基中制成濃度為108 CFU/ml懸液備用。

1.4 細菌培養及黏附

將上述材料各取4片分別置入結核桿菌及表皮葡萄球菌菌液中37℃恒溫共同培養。在結核桿菌與材料共同培養的過程中，每5 d各取出材料1片；在表皮葡萄球菌與材料共同培養的過程中，每4 h各取出材料1片。此實驗步驟重復進行6次。

1.5 材料表面細菌黏附情況的電鏡觀測

將取出材料用生理鹽水洗滌3遍去除表面的培養液及未黏附的細菌，然后置入2.5%戊二醛中固定4 h，再分別用70%、80%、90%、95%的乙醇逐級脫水，室溫下自然干燥，在掃描電鏡（S-3000N，HITACHI）下觀測各材料表面的細菌黏附情況。在每片材料上隨機選取10個視野，計算黏附細菌總數并求出每視野內細菌數均值，以時間為變量繪制細菌黏附曲線圖。

1.6 統計學方法

以細菌種類分類、材料性質分類作為分組變量，取黏附曲線圖中各材料黏附不同細菌數量最高值為觀測指標，對表1所示統計資料行兩因素析因設計定量資料方差分析，采用SPSS17.0軟件進行統計計算。

2 結果

2.1 以時間為變量的細菌黏附曲線圖

根據圖1、2發現，結核桿菌黏附數量開始隨時間推移逐步增多，到培養第10 d到達高峰并基本維持穩定，黏附數量有少許波動；表皮葡萄球菌在培養4 h第1次取出材料檢測時黏附數量即在高峰值，而后3次黏附數量稍有下降。

圖1 結核桿菌對不同材料的黏附動態曲線

圖2 表皮葡萄球菌對不同材料的黏附動態曲線

2.2 結核桿菌和表皮葡萄球菌對同種材料黏附的對比

根據表1可以發現在不銹鋼、鈦及鈦合金材料上，表皮葡萄球菌的黏附數量都明顯高于結核桿菌的黏附數量，隨后的表2方差分析結果提示2種細菌對同種材料的黏附差異具有統計學意義。

2.3 不同材料上的結核桿菌黏附比較

根據表1可以發現在不銹鋼材料上結核桿菌的黏附數量要高于鈦及鈦合金材料上的結核桿菌的黏附數量，隨后的表2方差分析結果也提示結核桿菌對不銹鋼材料的黏附量與其對其他2種材料的黏附量之間的差異有統計學意義。

表1 2種細菌在不同材料表面黏附最高數量均值±s，n=6，個·視野－1

表1 2種細菌在不同材料表面黏附最高數量均值±s，n=6，個·視野－1

材料 結核桿菌 表皮葡萄球菌不銹鋼 9.78±0.884 132.56±6.40純鈦 6.52±1.22 78.65±10.84鈦合金 5.81±0.91 89.51±11.33

表2 統計分析結果

3 討論

在前言中已經提到，細菌對生物材料的黏附是引起生物材料相關感染的初始動因，既往研究表明，細菌對材料的黏附是一個動態變化的過程，而且與細菌的生長關系密切[5]。所以本次實驗中將結核桿菌和內固定材料一起培養動態觀察細菌的黏附情況。筆者選擇生物材料相關感染中常見的致病菌表皮葡萄球菌作為本次實驗的對照細菌，實驗中將培養和取材觀察步驟重復進行6次以減少隨機誤差。不同細菌在培養液中的生長傳代周期不同，表皮葡萄球菌和臨床常見細菌一樣，生長速度快，一般20min就可繁殖一代；而結核桿菌對營養需求高，生長較慢，一般需14~18 h繁殖一代[6]。在實驗中根據細菌生長的速度分不同時段4次取出材料觀察表面的細菌黏附情況，繪制出動態黏附曲線圖，結果證實兩種細菌對材料的黏附均是一個動態變化的過程，因本次實驗未進行細菌的傳代測定，所以均取4個時段中黏附數量最高1次的數據進行統計分析，可以較為準確地反映細菌對材料的最大黏附能力，結果發現在3種材料上表皮葡萄球菌的黏附數量均明顯高于結核桿菌，也就是說明結核桿菌對生物材料的黏附能力明顯弱于臨床常見致病菌表皮葡萄球菌，不易導致以內固定材料為中心的結核慢性感染或感染復發。探討其原因仍考慮結核桿菌作為特異性感染的菌源，一方面可能因其對生長環境營養要求高、生長速度緩慢、生物學活性相對較弱；另一方面和該細菌缺乏菌毛、鞭毛、莢膜以及分泌的ESS等黏附素，難以形成細菌表面的黏附配體和包繞內固定材料表面的生物膜有重要相關。

近年來隨著醫用材料學的發展，骨科內固定材料的研制更新也是日新月異。本次實驗采用了臨床最常用的內固定材料不銹鋼、鈦及鈦合金，而且材料表面粗糙度和臨床使用產品保持一致，所以實驗結果對臨床內固定材料的選擇更具指導意義。材料表面的化學組成、臨界表面張力、界面能、表面親水、疏水性、表面電荷等對細菌的黏附均有較大影響，所以不同材料即使對同種細菌的黏附力也是有差別的[4]。在本次實驗中也發現結核桿菌對3種不同材料的黏附數量存在差別，在本次實驗結果經統計分析表明在體外結核桿菌對不銹鋼材料的黏附力明顯強于鈦和鈦合金材料，而對后兩種材料的黏附力沒有顯著的差別。通過本次實驗研究，認為脊柱結核患者行病灶清除植骨內固定的術式是合理安全的，不易誘發術后結核感染遷延不愈或復發，在內固定材料的選擇上，筆者推薦使用鈦或者鈦合金材料。

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