骨折預(yù)處理對兔骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞的影響

席冬梅，曾 勇

（三峽大學(xué)仁和醫(yī)院骨科，湖北 宜昌443001）

骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，MSC）在特定的生理和病理情況下，能遷移到特定的組織器官參與組織的修復(fù)重建[1-2]，且其作為骨組織工程的種子細(xì)胞已得到廣泛應(yīng)用[3]。目前的研究多集中于后期處理對MSC功能及分化的影響，而前期對所取得骨髓標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理的研究比較少見。因此，本研究對比了骨折預(yù)處理對兔MSC的影響，旨在為其更好地應(yīng)用于骨組織工程及其功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基購于美國Gibco公司，磷酸鹽緩沖液（PBS）購于武漢博士德生物工程有限公司。流式細(xì)胞儀購自美國BD公司（型號：FACSCalibur）。

1.2 動物分組及骨折模型制作

12 周齡兔 10 只，雌雄不限，體質(zhì)量（2 512±48）g，購于三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心。按隨機(jī)數(shù)字表法分為骨折預(yù)處理組和對照組，每組5只。將骨折預(yù)處理組兔麻醉后沿股外側(cè)肌間隙鈍性分離進(jìn)入到達(dá)股骨干，在脛骨干中1/3段用線鋸鋸斷成橫形骨折，以直徑3mm克氏針作逆行髓內(nèi)固定，骨折固定牢固后，用生理鹽水沖洗傷口，碘伏消毒，關(guān)閉傷口。對照組未進(jìn)行任何處理。

1.3 MSC的培養(yǎng)

骨折預(yù)處理組骨折模型制作好7 d后，從另一側(cè)股骨處無菌抽取骨髓1～2 mL，用 5 mL PBS混勻后，離心機(jī)（1 000 r·min-1）離心 10 min。 將沉淀的MSC細(xì)胞重懸于5 mL 10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)液中，2×106個接種于塑料培養(yǎng)瓶中。對照組從股骨抽取骨髓培養(yǎng)，方法同骨折預(yù)處理組。

1.4 MSC的周期測定

待細(xì)胞已鋪瓶底＞80%后，采用酶消化法常規(guī)消化細(xì)胞，離心，棄上清，PBS沖洗2次，加入4℃預(yù)冷的70%乙醇3 mL固定過夜。DPBS（杜氏磷酸緩沖液）洗滌、離心2次后，棄上清。細(xì)胞重懸于50μg·mL-1的 PI染液（含 50 μg·mL-1的 RNase）中，37 ℃避光水浴30min。300目濾布過濾，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。實驗重復(fù)3次。傳代（P2-4）細(xì)胞用于實驗。

1.5 MTT（噻唑蘭）比色實驗

分別檢測骨折預(yù)處理組與對照組傳代細(xì)胞（分別用P2、P3、P4表示）的增殖能力。常規(guī)消化對數(shù)生長期的細(xì)胞，接種于培養(yǎng)基96孔板中，培養(yǎng)24 h后棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，PBS沖洗。加無血清DMEM后繼續(xù)培養(yǎng)至所設(shè)定的時間，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入180μL無血清DMEM （達(dá)氏必須基本培養(yǎng)基）＋MTT溶液20μL 37℃孵育4 h，吸出培養(yǎng)液，加150μL DMSO（二甲基亞砜），然后將孔板放置于搖床震蕩10min。上酶標(biāo)儀，選擇490 nm波長，測各孔吸光度值，每組設(shè)5個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 MSC的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

2組接種24 h后首次換液，對照組僅出現(xiàn)少量細(xì)胞貼壁現(xiàn)象（封四圖1A）；骨折預(yù)處理組貼壁細(xì)胞較多，并出現(xiàn)細(xì)胞集落（封四圖1B）。之后2～3 d骨折預(yù)處理組貼壁細(xì)胞明顯增大并迅速開始分裂增殖，細(xì)胞伸出突起，呈梭形、紡錘形和多角形，細(xì)胞集落迅速增多，互相融合，5 d可鋪滿瓶底至80%左右（封四圖1C），已可進(jìn)行傳代。而對照組此時僅鋪瓶底約40%左右（封四圖1D），在8～9 d后可進(jìn)行傳代。

2.2 骨折預(yù)處理對MSC增殖的影響

骨折預(yù)處理組MSC的增殖能力明顯強(qiáng)于對照組，在 P2、P3 代時 MSC 高于對照組（均P＜0.05）；隨著時間的延長，P4代時2組MSC增殖能力比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 見表 1。

表1 2組P2、P3、P4代時MSC增殖能力的比較 ±s

表1 2組P2、P3、P4代時MSC增殖能力的比較 ±s

*P＜0.05與對照組比較。

組別 n P2 P3 P4對照組 5 0.936±0.054 0.833±0.040 0.879±0.063骨折預(yù)處理組 5 1.111±0.084* 1.097±0.096* 0.887±0.043

2.3 細(xì)胞周期的測定

P4代MSC采用流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：骨折預(yù)處理組MSC中G0/G1期細(xì)胞為70.65%，G2/M期細(xì)胞為10.40%，S期細(xì)胞為18.95%；對照組MSC中G0/G1期細(xì)胞為72.40%，G2/M期細(xì)胞為11.35%，S期細(xì)胞為16.25%。2組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＞0.05）。

3 討論

MSC具有向骨、軟骨、脂肪、肌肉、肌腱及骨髓間質(zhì)等多種間充質(zhì)組織分化的潛能，并且當(dāng)機(jī)體某個部位受到損傷或發(fā)生慢性炎癥時，具有多向分化潛能的MSC及其衍生因子會向受損部位募集，參與組織的重建[4]。 有研究[5-6]表明，骨折后機(jī)體在創(chuàng)傷及缺氧等刺激下也會產(chǎn)生一系列炎癥因子和趨化因子，如白細(xì)胞介素、集落刺激因子、SDF-1等，通過因子和受體的結(jié)合產(chǎn)生一系列的作用從而構(gòu)成了骨折修復(fù)的復(fù)雜級聯(lián)反應(yīng)過程，包括MSC動員、募集到骨折部位及其增殖和分化為骨組織。此級聯(lián)炎癥反應(yīng)階段發(fā)生在創(chuàng)傷后 48～72 h[7]，在此期間抽取外周血培養(yǎng)出的 MSC形成的集落數(shù)比其他時間點多[8]。

因此，筆者推測在骨折修復(fù)過程中，因為炎癥因子和趨化因子的作用，MSC會表現(xiàn)的更加活躍。本研究發(fā)現(xiàn)，骨折預(yù)處理組7 d后采用全骨髓貼壁法培養(yǎng)的MSC更容易出現(xiàn)貼壁現(xiàn)象，且細(xì)胞集落出現(xiàn)較早，在24 h首次換液后即可出現(xiàn)；首次傳代時間也出現(xiàn)的較早，約5 d左右。而對照組則需8～9 d才可以鋪滿瓶底至80%左右，進(jìn)行傳代，初步證實了筆者的推測。

通過進(jìn)一步的研究，筆者發(fā)現(xiàn)，骨折預(yù)處理組P2-3代的MSC具有比對照組更強(qiáng)的增殖能力，但該增殖能力經(jīng)過多次傳代后，至P4代時消失。推測隨著傳代的增加及時間的推移，機(jī)體內(nèi)環(huán)境對其的影響逐漸去除，至P4代時MSC已完全恢復(fù)正常。有研究表明：腦外傷患者血清表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)成MSC 增殖的作用[9]。還有研究[10]表明：雖然白血病細(xì)胞對MSC的增殖有明顯的抑制作用，但經(jīng)過多次傳代后去除了白血病細(xì)胞的影響，即可恢復(fù)MSC的正常增殖特性。因此表明白血病骨髓 CFU-F數(shù)目減少，但其MSC的功能是正常的。這些均與本研究的結(jié)果較為一致。

因此，筆者認(rèn)為，骨折預(yù)處理全骨髓貼壁法可在更短的時間內(nèi)成功的培養(yǎng)出穩(wěn)定的MSC，并且該細(xì)胞在P2-3代具有更強(qiáng)的增殖能力，直至P4代恢復(fù)常態(tài)，但導(dǎo)致其增殖能力提高與恢復(fù)的具體機(jī)制還需要研究者進(jìn)一步的研究。

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