靈芪膠囊對S180荷瘤小鼠組織形態學改變的影響

李環，蘇云明

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

肺癌是嚴重危害人類健康的疾病之一，具有高死亡率，高致殘率的特點。目前肺癌的治療并未取得理想的效果。而中藥及復方有效地補充了常規治療的缺陷［1－2］。靈芪膠囊是一種中藥復方制劑，具有很好的抗癌作用。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

昆明種小鼠，由黑龍江省藥物安全性評價中心提供，符合實驗要求，體質量(22±2)g，雌雄各半，合格證號:黑動字第P00101006號。

1.2 實驗瘤株

小鼠實體型移植肉瘤180(S180)，由哈爾濱醫科大學第三附屬醫院腫瘤研究所提供。

1.3 藥物

靈芪膠囊(靈芝、黃芪、綿馬貫眾、重樓、山慈菇、人參、山藥、枸杞、五味子、茯苓組成，由黑龍江中醫藥大學藥理教研室提供。每粒膠囊含生藥約1.65g，實驗時臨時配制成溶液);復方環磷酰胺片(天津金世制藥有限公司，國藥準字H12021006)。

1.4 主要實驗儀器

超凈工作臺;電子天平;真彩色病理圖像分析系統;微量加樣器;輪轉式組織切片機等。

2 實驗方法

2.1 實驗分組及給藥

造模成功之后，將實驗動物隨機分為6組，每組10只，實驗分組及其給藥劑量如下:靈芪膠囊高劑量組(5.00g/kg)，靈芪膠囊中劑量組(2.50g/kg)，靈芪膠囊低劑量組(1.25g/kg)，靈芪膠囊中劑量+復方環磷酰胺組，模型對照組(同等容積0.9%Nacl)，陽性對照組給予復方環磷酰胺片(39mg/kg)。于接種瘤株24h后分組，為灌胃給藥，給藥時間為連續21天。

2.2 電鏡觀察瘤組織的組織形態學

超凈操作臺內抽取傳代7f、生長狀態良好的S180荷瘤小鼠的腹腔積液，在冰盤上進行操作，以無菌生理鹽水按照1∶3的比例進行稀釋，按體積0.2ml/只接種實驗動物右前肢腋部皮下，注射前先行常規消毒。24h后給藥，給藥時間為連續11天，停藥后，第二天稱取小鼠體重，然后處死實驗動物，手術取出取瘤塊，進行固定。

取材與固定:將正常生長的瘤塊打碎成為組織勻漿液，用PBS緩沖液洗滌3次，最后一次將細胞轉移到1.5ml的 EP管中，在低溫高速離心機中離心，12 000rpm，－4℃，5min，去除上清液，立即轉入固定液(2%戊二醛液均可)pH值7.2，4℃固定時間約4h。

倒掉固定液，用0.1M，pH值7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品3次，每次15min;用1%的鋨酸溶液固定樣品1～2h;倒掉固定液，用0.1M，pH值7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品3次，每次15min;應徹底漂洗干凈，減少固定液與固定液或與脫水劑之間的反應。

丙酮梯度脫水:脫水是將組織中的游離水徹底清除的過程。由于常用的包埋劑大都是非水溶性樹脂，只有將生物組織中的游離水清除干凈，包埋劑才能浸入組織。丙酮梯度脫水濃度配比見表1。

表1 丙酮梯度脫水濃度配比

脫水過程中應注意:逐級脫水而不能急劇脫水;更換溶液時動作要快，特別是不要讓組織離開溶液，否則會在組織內外產生氣泡;脫水過程中若要長時間停留或過夜，應放在70%脫水劑中，并在4℃保存。

包埋與滲透:滲透就是用包埋劑逐漸取代組織中的脫水劑，使細胞內外空隙被包埋劑所填充。包埋劑通常由樹脂、硬化劑、增塑劑及催化劑4種試劑按一定比例配制而成。

把細胞塊放入包埋模具的頂端，再放入實驗標簽，然后加入包埋劑。包埋劑配制及使用過程中的注意事項:所有容器及玻璃棒等應是清潔和干燥的;配制過程中應攪拌均勻，使用過程中應避免異物，特別是水、乙醇、丙酮等混入包埋劑;配制好的包埋劑應密封保存，避免受潮。剩余包埋劑可密封并儲存在－10℃ ～－20℃冰箱中，延長其使用期。

聚合:37℃烘箱內過夜，45℃烘箱內12h，60℃烘箱內24h。

標本的修整:將細胞塊從溫箱中取出，用修塊機修整，曝露細胞，在用修塊機或刀把曝露出的細胞團修整成45°角立體梯形。

半薄切片的制備:把包埋后修整好的細胞團，切成厚度 0.5 ～1.0μm，最大切片面積 2mm2，目的是補充光鏡下所觀察的內容，定位制備超薄切片。

超薄切片的定位:超薄切片的面積為0.55mm2，因此在進行超薄切片前必須將細胞團細切，盡量保留所要觀察的部位，但保留的部位不能太大，否則影響切片質量。

載網:將切片附在金屬載網膜面上。

2.3 醋酸鈾－枸櫞酸鉛雙染色 電子染色法是利用重金屬于細胞的密歇成分結合或吸附，在電子束的照射下，樣品形成不同的散射能力，而提高了圖像的反差。

3 結果 見圖1。

圖1 電鏡觀察瘤組織的組織形態學圖片(11 500×)

空白對照組:細胞多呈現圓形，表面有大小不等的突起和長短不一的絨毛，核形不規則，核仁清晰。胞漿雙層膜結構清晰，可見線粒體，粗面內質網，游離核糖體。核膜輕度生理性皺縮，細胞表面可見微絨毛和較大突起。

靈芪膠囊高劑量組:部分細胞胞漿空泡變性，部分細胞固縮壞死。胞漿內可見大小不等的空泡狀結構，線粒體髓樣變性，粗面內質網明顯減少，雙層膜結構不清晰。粗面內質網脫顆粒。細胞膜破損，細胞核腫脹，異染色質邊集，線粒體空泡變性，大部分線粒體腫脹。細胞器結構模糊，核膜不清晰，細胞膜破損。

靈芪膠囊中劑量組:大部分細胞崩解壞死，異染色質邊集，細胞體成凋零狀。胞漿內可見大量的自噬體，細胞膜不清晰，內質網，游離核糖體明顯減少。部分線粒體腫脹，部分線粒體嵴融合，粗面內質網脫顆粒，游離核糖體減少。細胞器結構模糊。細胞形態不規則，細胞突起明顯減少，細胞膜不完整，細胞器膜性結構融合。部分細胞細胞器結構消失，胞漿內殘存少量游離核糖體。

靈芪膠囊低劑量組:細胞膜，核膜清晰，突起，微絨毛明顯減少。粗面內質網擴張，脫顆粒，可見自噬體。核膜結構清晰，線粒體明顯腫脹，核糖體減少。

陽性對照組:部分細胞崩解壞死，部分細胞核異染色質邊集，核膜結構不清。核膜結構清晰，可見線粒體結構完整，粗面內質網，游離核糖體。雙層膜結構清晰，線粒體豐富，有大量粗面內質網，游離核糖體。細胞多呈圓形，核膜曲度變大，核仁清晰。核膜結構清晰，線粒體膜完整，線粒體結構尚正常。自噬體，為用藥導致細胞器損傷。部分細胞漿內可見大小不等的空泡。核膜雙層膜結構消失融合，線粒體空泡變性，部分細胞凋零樣變性。

4 結論

細胞形態學觀察顯示，靈芪膠囊可促進腫瘤細胞的凋亡及壞死，并引發相應的炎細胞反應。

［1］王重洋，關欣，宋武元，等.艾迪注射液聯合化療治療晚期非小細胞肺癌臨床觀察［J］.中醫藥學報，2011，39(2):43 －44.

［2］楊靜.淺談肺癌從脾胃論治［J］.中醫藥學報，2011，39(3):144－146.