昆蟲分子生物學分類技術及在植保上的應用前景

任海英，李 彤

（1.河南省衛輝市農業技術推廣中心，河南 衛輝453100；2.河南省農業科學院植物保護研究所，河南 鄭州450002）

1 引言

昆蟲經過約3億8千萬年的演化，已經發展成為地球上種類繁多、數量巨大、分布廣泛的動物類群之一。目前，已經定名的昆蟲約有100多萬種，占已知動物數量的2／3，但據不完全統計全世界仍約有90%的昆蟲是還未定名的［1］。

傳統的昆蟲分類研究是通過觀察、對比昆蟲的外部形態特征，尋找昆蟲間的差異，從而達到分類鑒定的目的。昆蟲中常用的分類特征有翅脈、口器、觸角、生殖器、足及其跗節等。這些分類特征在高級分類單元中可以很好地反映物種的分類地位，但在小的分類單元，如屬、族、種內則不容易確定物種的分類地位，再到種群、生態型則更難確定分類地位。為此，必須尋找更細的形態特征，如某些部位毛片的形態、分布等，但這些特征又容易受非遺傳穩定性的影響，而導致錯誤的結果［2］。傳統的昆蟲分類一方面具有直觀、簡單、快捷等優點，另一方面它又受制約于研究人員的主觀意識，需要研究人員具有豐富的分類經驗，而一個好的分類人員往往需要多年的培養。

隨著科學技術的進步與各個學科的交叉滲透，已有200多年歷史的昆蟲分類學也獲得了極大的發展。20世紀80年代以來，結合遺傳學、生物化學和分子生物學背景的分類學技術已經廣泛地應用到昆蟲的分類研究中［3，4］。本文針對分子生物學技術在昆蟲分類上的應用與發展進行闡述，對其在植保部門中的應用前景進行了分析。

2 昆蟲分子生物學分類技術和方法

2.1 分子雜交技術

分子雜交技術（Molecular hybridization）是分子生物學中應用最廣的技術之一，包括Southern分子雜交技術、Northern分子雜交技術和原位雜交技術。其基本原理是具有一定同源性的兩條核酸單鏈分子，在一定的條件下可按堿基互補原則，通過退火形成雙鏈，在高度嚴格的實驗條件下，不同種的核酸僅在互配的序列上配對，具有高度的特異性。Collins（1987）和牛玲玲等（1992）使用DNA探針雜交方法在雙翅目按蚊屬的類群中進行了分類研究［5，6］。分子雜交的好與壞，關鍵在于探針的選擇，下面簡述DNA探針的篩選方法：

（1）使用限制性內切酶對基因組DNA進行酶切反應，根據酶切片段的多態性，選擇并回收合適的DNA片段，使用同位素將其標記為特異性的探針［6，7］。

（2）通過酶切、克隆的方法構建相應物種的基因文庫，將其近緣物種的總DNA標記為探針，在基因文庫中進行雜交，從中篩選出該物種特有的基因片段，標記為探針。

（3）根據核糖體基因的多態性，從基因文庫中直接篩選核糖體基因探針。雖然雜交技術用于昆蟲鑒定具有高度的特異性、精確性和敏感性［8］，但也有學者提出DNA探針的“種的特異性”有一定的適用范圍［9］。另外，DNA探針的制備與使用總體費用較高，操作技術比較繁瑣，并且同位素對人體具有一定的危害，這也制約了分子雜交技術在昆蟲分類中的進一步推廣與發展。

2.2 基因片段的體外擴增技術

1985年Kary Mullis等創建特異DNA片段的體外擴增的技術，主要是利用聚合酶依賴于DNA模板的特性，模仿體內的復制過程，在一對引物之間誘發聚合酶反應，由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應組成一個周期，循環進行。因此，該技術被命名為聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）。PCR的意義和影響甚至比限制性內切酶等更為深遠，是分子生物學領域的一次創舉，在一定程度上替代了傳統的DNA克隆方法［10］。Kary Mullis也因此獲得了1993的諾貝爾化學獎。就PCR循環條件來說，一般30～35個循環足以得到目的產物，其中退火溫度的選擇至關重要，原則上退火溫度過低，會造成非特異性產物量增加，過高則會無擴增產物。在PCR基礎上，又迅速發展起來了一系列DNA多態檢測技術，如RFLP、RAPD、SSCP等，并很快被用于多種生物的物種鑒定、系統進化等的研究中。樸美花等（2002）用PCR技術對采于1980年和1987年的松毛蟲脊繭蜂干標本進行基因組DNA的提取和PCR擴增均獲得成功［11］。Nielsen等（1999）利用形態學和以PCR技術為基礎的線粒體分型技術來識別非洲化蜜蜂，成功區別了來自4個種族的母系后代［12］。

2.3 RFLP技術

RFLP技術（限制性片段長度多態性分析，Restriction fragment length polymorphism）是基于不同的個體在等位基因上存在著堿基組成的差異，通過限制性內切酶識別特異的酶切位點，將這些堿基差異反映在酶切片段的大小和組成上，從而達到區分的目的。目前，RFLP技術一般和PCR技術一起使用。在使用RFLP技術鑒定物種時，若需鑒別的物種具有較小的基因組或目的基因序列較短，其酶切片段的多態性直接可以通過跑聚丙烯酰胺膠或瓊脂糖凝膠進行觀察；但對于大分子DNA來說，其鑒定還需和DNA雜交技術相結合。喬傳令等（1996）對庫蚊的限制性內切酶片段長度多態性（RFLP）進行實驗研究，結果表明不同地理種群都有相同的單基因擴增，但擴增水平上有較大差異［13］。龍漫遠（1993）針對線粒體DNA進行了相應的RFLP研究，得到了其相應的酶切圖譜和片段多態性［14］。趙惠燕等（1997）利用同樣的方法在同翅目昆蟲中進行了分類研究［15］。應用RFLP分析方法，使傳統的昆蟲分類和區系進化研究有了新的發展和飛躍，并且解決了一些利用傳統分類方法不能解決的問題。

2.4 RAPD技術

RAPD技術（隨機擴增DNA多態性分析，Random amplified ploymorphic DNA）是1990年由 Willioms和Welsh兩個研究小組同時發展起來的一項分子多態性檢測技術。RAPD標記的產生是基于一種可能性，即一段與某一單一引物RAPD（一般用10聚體引物）同源的DNA序列［16］，有可能在DNA模板另一條鏈上的不同位置上出現，這些位置之間的距離又處于通過PCR進行擴增的長度范圍。因此，當條件滿足時，單個寡核苷酸引物就可以在PCR反應中介導DNA呈幾何級數擴增。經RAPD檢測，大多表現為某一個擴增產物出現或消失，這意味著RAPD通常可用作顯性標記［17］。通過對RAPD的結果分析和相應序列的測序，可以篩選出針對于某一種群、生物型或物種的特有片段，并根據其序列設計特異引物，達到特異性檢測的目的，從而延伸出了一種更加特異的檢測技術——特征序列擴增區域（sequence characterized amplified region，SCAR）。RAPD技術已經被應用在蚊蟲的分子系統學研究中［18～20］。蘇松坤等（2002）利用 RAPD分子遺傳標記，篩選出了5種引物，這些引物所擴增的RAPD標記可作為鑒別歐洲蜜蜂和非洲蜜蜂的分子標記［21］。

2.5 SSCP和DSCP技術

SSCP方法（單鏈構象多態性分析，Single－strand conformational polymorphism）和DSCP方法（雙鏈構象多態性分析，Double－strand conformational polymorphism）的基本原理相似，采用PCR技術擴增出某一特定的DNA片段，在高溫下使雙鏈DNA變性為單鏈DNA（ssDNA），然后進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結束后，ssDNA帶在凝膠中位置的差異反映了DNA序列的差異。

2.6 DNA條形碼技術

DNA條形碼（DNA Barcoding）是由加拿大生物學家Paul Hebert等提出的生物快速鑒定的概念［22］，是通過在不同的生物類群中選擇合適的基因片段，針對基因片段的序列進行分析，將物種的差異反映在基因序列上，從而達到區分物種的目的，類似于超市中分類貨物所使用的條形碼。目前全世界生物共有1580920條已公布的Barcoding序列信息，其中昆蟲有1036188條，詳見DNA 條形碼網站（http：／／www.boldsystems.org／views／login.php）。昆蟲DNA條形碼鑒定中選擇的基因是線粒體細胞色素C氧化酶亞基I（COI），其具有穩定、易擴增、變異速率適中等優點。DNA條形碼鑒定物種的操作步驟如下。

（1）使用通用引物在待測樣品DNA中進行基因擴增；

（2）測序得到相關序列；

（3）將序列提交網站和數據庫已有序列進行比對；

（4）網站根據比對結果，給出樣品最相似的物種信息。

我國作為DNA條形碼國際組織中的一個重要節點，大量的相關研究工作正在開展。

3 昆蟲分子生物學鑒定技術在植物保護中的應用

植物保護是針對于田間作物病蟲害預警與防治的一門科學，是我國糧食生產安全的重要保障。據不完全統計現在全國共有縣級以上植保技術推廣和管理機構2905個，其中地、市、縣級2342個，鄉（鎮）級綜合性農技服務的農技站30000余個，其中基層植保部門在病蟲害的預警與相關防治方法的推廣上扮演著重要的角色。害蟲防治一直是植保工作中的重要一環，但要做到防治，首先要學會識別。因此，昆蟲分類對于更好地開展植保工作也是必須的。目前，由于多種原因，在基層植保部門中，往往缺少具有昆蟲分類知識的高級技術人才。

傳統的分類學技術具有直觀、簡單、快捷、經濟等優點，并且歷史悠久，形成了一套相對成熟的分類系統，但是這種方法依賴經驗的積累，需要較長時間的系統學習才能掌握，而且其擴展性不強，也就是說某個昆蟲類群的分類專家并不能完成其他類群的分類鑒定。而現代生物學技術則具有準確、客觀、靈敏等優點，能夠鑒定出形態學不能區分的昆蟲親緣種，正好彌補形態學方法的不足，而且其操作性更強，不需要掌握大量的分類知識，僅僅需要相關的分子生物學知識，就能在多個類群中開展。另外，現在分子生物的儀器、試劑和測序費用大幅降低，也使得在基層植保部門當中適當開展相應的分子生物學昆蟲鑒定成為可能。

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